——简单、快速、高效的克隆策略
Topo克隆技术是通过TOPO载体上偶联的异构酶(Topoisomerase)实现插入片段的快速克隆。不同于传统的TA克隆,Topo克隆技术能够在2-5 min内快速完成插入片段和载体的连接反应,操作简单,连接效率极高,克隆阳性率接近100%。
背 景
传统的TA克隆对于PCR产物的要求较高,而且连接反应时间很长,同时阳性率低,而且自连率很高,无形中会成倍地增加科研者宝贵的时间。翌圣生物推出Hieff Clone® TOPO系列克隆载体,能够快速而且高效地得到目的重组载体。Hieff Clone® Zero TOPO载体为零背景载体,载体骨架中含有自杀ccdB基因。此克隆方法无需蓝白斑筛选,阳性率100%。
Hieff Clone® Zero TOPO Simple系列载体,使用者在引入后续酶切位点进行酶切操作时,不会受到MCS位点的影响,从而增加酶切效率以及克隆成功率。
TOPO克隆原理
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克隆原理:Topo载体两端通过磷酸键偶联Topo酶,连接反应时,受插入片段的5'端羟基的攻击,磷酸键释放能量。利用该能量,插入片段5'端羟基与载体片段3'端磷酸基团连接在一起,Topo异构酶从载体分子上脱落,完成连接反应。 |
零背景载体:Hieff Clone® Zero Topo载体骨架中含有ccdB致死基因。当载体发生自连时,ccdB基因完整,会表达ccdB毒素蛋白,导致细菌死亡;当插入片段成功连接时,ccdB基因不完整,ccdB基因不能完整表达,细菌存活。 |
Zero TOPO克隆与TA克隆方法的比较
类别 |
反应时间 |
反应温度 |
体系组成 |
克隆阳性率 |
PCR产物 |
Zero TOPO |
2-5 min |
室温 |
载体+插入片段 |
★★★★★ |
Blunt载体无需加“A” |
TA克隆 |
过夜 |
16℃ |
载体+插入片段+T4连接酶 |
★★ |
需要加“A” |
产品特点
快速:仅需2-5 min即可完成连接反应
高效:无自连现象,阳性克隆率100%
简便:只需加入目的片段即可
操作流程
产品实例
高效克隆1-5 kb基因
图1:Hieff Clone® Zero TOPO-Blunt Cloning Kit可有效克隆1-5 kb基因,成功率100%。A-C:TOPO克隆转化平板。D-F:插入片段PCR鉴定电泳图。
同类产品比较
图2:相同体系下,克隆3 kb目的基因,Hieff Clone®Zero TOPO-Blunt Cloning Kit较同类产品具有高连接效率。
部分发表文献
[1]. Tang Y Y, Li Y T, Zha X H, et al. A complement factor I (CFI) gene mediates innate immune responses in yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco[J]. Genomics, 2020.
[2]. Zhu L, Xia C, Wu L, et al. The critical role of RasGRP4 in the growth of diffuse large B cell lymphoma[J]. Cell Communication and Signaling, 2019, 17(1): 92.
[3]. Liu Q, Zhang L, Shu Z, et al. Two paternal mosaicism of mutation in ELANE causing severe congenital neutropenia exhibit normal neutrophil morphology and ROS production[J]. Clinical Immunology, 2019, 203: 53-58.
[4]. Zhuang L, Ji Y, Tian P, et al. Polymerase chain reaction combined with fluorescent lateral flow immunoassay based on magnetic purification for rapid detection of canine parvovirus 2[J]. BMC veterinary research, 2019, 15(1): 30.
FAQ
» Q1:从质粒上酶切的产物可直接连接Topo载体吗?为什么?
A:Topo载体进行连接反应的时候需要5'羟基端和Topo酶发生反应。PCR产物5'羟基端没有磷酸化,可以直接进行TOPO克隆。但是,酶切产物5'端为磷酸化状态,可以直接进行TA克隆的,但是不能进行Topo克隆。如果需要,可以用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)进行去磷酸化处理后连接Topo载体。
» Q2:连接反应体系和反应时间以及温度对连接效率的影响大吗?
A:建议反应体系应控制在10 μL内,体系太小连接会受到影响。如果目的基因浓度太低,建议浓缩之后再连接,以提高连接成功率。插入片段使用量参考说明书。一般1-2 min即可完成连接反应,若想得到更多克隆,可适当延长至 5min,但不能超过5 min。室温反应即可。
» Q3:如何选择合适的载体?
A:若PCR产物为Taq酶扩增则选择TOPO-TA克隆载体系列,若PCR产物为高保真酶扩增则选择Blunt载体系列。Simple载体不含多克隆位点区,可根据客户需求在PCR扩增时添加自己需要的酶切位点。
» Q4:若是储存了很久的PCR产物还能用来做克隆吗?
A:建议采用新鲜的PCR产物会使连接效率更高一些,若是-20℃保存的一周内还可以使用。请避免PCR产物的反复冻融和降解。
» Q5:PCR扩增产物需要纯化吗?
A:先对PCR产物跑胶鉴定,若是PCR产物电泳条带单一、浓度较高且无引物二聚体可直接进行连接反应。若是有杂带或引物二聚体建议纯化之后再进行连接反应。
产品信息
名称 |
货号 |
规格 |
Hieff Clone® Zero TOPO-TA Cloning Kit 零背景TOPO-TA克隆试剂盒 |
10909ES20 |
20 T |
Hieff Clone® Zero TOPO-Blunt Simple Cloning Kit, MCS-Depleted |
10910ES20 |
20 T |
Hieff Clone® Zero TOPO-TA Cloning Kit |
10907ES20 |
20 T |
Hieff Clone® Zero TOPO-TA Simple Cloning Kit, MCS-Depleted |
10908ES20 |
20 T |
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