首页/ 产品解读 / 新闻详情

攻无不“克”的无缝克隆为何备受青睐?

导读

 
在经历了多次PCR、酶切、连接、转化后,有些小伙伴仍会面临克隆阳性率低的情况,每一步都认真地完成,但仍然存在不少的问题。今天小翌给大家介绍一下近年来备受科学家们青睐的“无缝克隆”。相比于传统的酶切克隆,无缝克隆更快更灵活,不受酶切位点限制,可以在质粒的任何位点进行一个或多个DNA片段的插入。
 

传统酶切克隆

1. 受限制性内切酶的限制
2. 连接效率低:T4 DNA连接酶连接效率具有序列的偏好性
3. 耗时长:酶连过夜
4. 多片段克隆困难
 
1647499200890576.png
图1.传统酶切克隆
 

无缝克隆

1. 无需考虑酶切位点,适用任意载体、任意片段
2. 阳性率高,可用于50 bp -10 kb的片段
3. 连接快速,20-30 min即可完成
4. 可用于多片段克隆、基因突变、多顺反子表达载体构建
 
1647499219650721.png
图2.无缝克隆
 
 
无缝克隆的原理
 
与传统的双酶切克隆一般,无缝克隆依赖于dsDNA的黏性末端进行互补配对,但无缝克隆并不使用内切酶来制造黏性末端,而是通过T5核酸外切酶来产生的。T5核酸外切酶能够沿着5’→3’方向,降解dsDNA,从而产生黏性末端,但是,T5外切酶并不能保证每一个片段5’端都会酶切成一样长的粘性末端。因此退火之后,无缝克隆中的DNA聚合酶会针对缺失的碱基进行添加,Taq连接酶催化碱基之间形成磷酸二酯键,将所有缺口补齐。
 
1647499246530241.png
图3.无缝克隆原理图
 
 
无缝克隆优势详解
 

1. 不受片段、载体序列的限制,可任意组装

 
传统的酶切克隆:克隆载体的多克隆位点需携带可用的单一酶切位点,同时酶切位点若存在于外源片段也会极大程度限制克隆。此外,还需要购买各式各样不同的内切酶。
 
无缝克隆:仅靠同源臂进行互补配对。
 

2. 可同时无缝地拼接多个片段

 
传统的酶切克隆:由于酶切位点的限制和酶切位点之间存在着一定的距离和交叉覆盖,可组装的片段有限,酶切克隆通常需要分多次拼接,一般只能拼接2-3个片段,耗时耗力。
 
无缝克隆:可同时拼接4-6个片段,并且只需要将所有片段混在一个试剂管中反应即可。
 

3. 操作简便,时间上大大节省

 
传统的酶切克隆:传统的片段和载体酶切均需要2-4小时,此外还需要对相关产物进行末端补平、磷酸化、产物纯化等一系列操作。为保证连接成功,还需在16℃条件下过夜连接。
 
无缝克隆:仅需PCR和胶回收,连接体系反应时间为20min左右,连接单个和多个片段的时间一致。相比于传统酶切克隆,可节约1天左右的时间。
 
 
无缝克隆操作步骤
 
1647499279507288.png
图4.无缝克隆关键步骤
 

1. 线性化载体制备

 
① 线性化方式:酶切或者PCR;
② 产物纯化:胶回收/PCR产物纯化;
 

2. PCR获取目的插入片段

 
5’引物需要和线性化载体末端15-25 bp的序列重叠。
 
小翌推荐使用引物设计工具: https://www.yeasen.com/hieff-clone/
 

3. 重组反应

按一定比例将线性化载体与插入片段进行混合,50℃反应20 min后即可用于转化。
 
分子克隆发展至今,翌圣利用同源同组的原理,匠心研发了多款一步法快速克隆产品。自产品上市以来,受到了诸多客户的支持,备受好评。以下是部分产品的性能展示:
 
1647499315843085.png
图5. Hieff Clone® One Step Cloning Kit(CAS#10911)试剂盒可以有效克隆不同长度的单片段基因。载体:4.7 kb。插入片段:1.2 kb,3 kb和5 kb。
 
1647499330996475.png
图6.Hieff Clone® Plus Multi One Step Cloning Kit(CAS#10912)试剂盒进行3个片段克隆。载体:10 kb。插入片段:1 kb,1.5 kb和2.5 kb。
 
1647499344571193.png
图7.Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit(CAS#10922)试剂盒进行5个片段克隆(上)、6个片段克隆(下)。载体:5 kb。插入片段:4kb(上)和5 kb(下)。
 
 
产品已发表文献
 

1. Jiang, Y., et al., Plants transfer lipids to sustain colonization by mutualistic mycorrhizal and parasitic fungi[J]. Science, 2017. (IF 37.205)
 

2. Liu C X, Li X, Nan F, et al. Structure and degradation of circular RNAs regulate PKR activation in innate immunity[J]. Cell, 2019. (IF 31.398)

 

3. Xing, Y.H., et al., SLERT Regulates DDX21 Rings Associated with Pol I Transcription[J]. Cell, 2017. 169(4): p. 664-678.e16. (IF 31.398)
 

4. Wang Y, Hu SB, et al. Genome-wide screening of NEAT1 regulators reveals cross-regulation between paraspeckles and mitochondria[J]. Nat Cell Biol. 2018 Oct;20(10):1145-1158. (IF 20.46)
 

5. Li X., et al., Coordinated circRNA Biogenesis and Function with NF90/NF110 in Viral Infection[J]. Mol Cell. 2017 Jul 20;67(2):214-227.e7. (IF 14.548)
 

6. Yao R W, Xu G, Wang Y, et al. Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus[J]. Molecular cell, 2019. (IF 14.548)

 

7. Wu P, Zhang T, Liu B, et al. Mechano-regulation of peptide-MHC class I conformations determines TCR antigen recognition[J]. Molecular cell, 2019, 73(5): 1015-1027. e7. (IF 14.548)
 

8. Qiao HH, Wang F, et al. An efficient and multiple target transgenic RNAi technique with low toxicity in Drosophila[J]. Nat Commun. 2018 Oct 8;9(1):4160. (IF 12.353)

 

产品推荐
 
分类
名称
货号
规格
单片段一步法克隆
Hieff Clone® Plus One Step  Cloning Kit 一步法快速克隆试剂盒
10911ES20
20 T
多片段一步法克隆
Hieff Clone® Plus  Multi One Step Cloning Kit 多片段一步法快速克隆试剂盒
10912ES10
10 T
单/多片段一步法克隆NEW
Hieff Clone® Universal One  Step Cloning Kit 通用型一步法快速克隆试剂盒
10922ES08/20
5/20 T
 

 

400-6111-883

PHP网站源码坪山建设网站荷坳SEO按天扣费观澜网站建设福田模板网站建设坪山seo排名坪地外贸网站设计吉祥SEO按天收费宝安阿里店铺托管横岗品牌网站设计木棉湾外贸网站建设民治优化大芬百姓网标王推广东莞百度网站优化排名双龙百度标王深圳关键词排名平湖网站建设龙华seo网站优化大运seo网站优化丹竹头网站搜索优化龙岗营销型网站建设坑梓网站建设设计同乐外贸网站设计民治网站推广平湖设计网站石岩seo网站推广福永网站推广工具塘坑英文网站建设同乐网站改版坪地百搜标王观澜关键词排名包年推广歼20紧急升空逼退外机英媒称团队夜以继日筹划王妃复出草木蔓发 春山在望成都发生巨响 当地回应60岁老人炒菠菜未焯水致肾病恶化男子涉嫌走私被判11年却一天牢没坐劳斯莱斯右转逼停直行车网传落水者说“没让你救”系谣言广东通报13岁男孩性侵女童不予立案贵州小伙回应在美国卖三蹦子火了淀粉肠小王子日销售额涨超10倍有个姐真把千机伞做出来了近3万元金手镯仅含足金十克呼北高速交通事故已致14人死亡杨洋拄拐现身医院国产伟哥去年销售近13亿男子给前妻转账 现任妻子起诉要回新基金只募集到26元还是员工自购男孩疑遭霸凌 家长讨说法被踢出群充个话费竟沦为间接洗钱工具新的一天从800个哈欠开始单亲妈妈陷入热恋 14岁儿子报警#春分立蛋大挑战#中国投资客涌入日本东京买房两大学生合买彩票中奖一人不认账新加坡主帅:唯一目标击败中国队月嫂回应掌掴婴儿是在赶虫子19岁小伙救下5人后溺亡 多方发声清明节放假3天调休1天张家界的山上“长”满了韩国人?开封王婆为何火了主播靠辱骂母亲走红被批捕封号代拍被何赛飞拿着魔杖追着打阿根廷将发行1万与2万面值的纸币库克现身上海为江西彩礼“减负”的“试婚人”因自嘲式简历走红的教授更新简介殡仪馆花卉高于市场价3倍还重复用网友称在豆瓣酱里吃出老鼠头315晚会后胖东来又人满为患了网友建议重庆地铁不准乘客携带菜筐特朗普谈“凯特王妃P图照”罗斯否认插足凯特王妃婚姻青海通报栏杆断裂小学生跌落住进ICU恒大被罚41.75亿到底怎么缴湖南一县政协主席疑涉刑案被控制茶百道就改标签日期致歉王树国3次鞠躬告别西交大师生张立群任西安交通大学校长杨倩无缘巴黎奥运

PHP网站源码 XML地图 TXT地图 虚拟主机 SEO 网站制作 网站优化