一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌及其构建方法和应用

本发明属于基因工程领域。具体涉及一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌komagataellaphaffiilnf013的构建。

本发明中所称的一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌，komagataellaphaffiilnf013，已于2021年3月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为cgmccno.22081。

背景技术：

纳豆激酶(nattokinase，nk)是一种由枯草芽孢杆菌(bacillussubtilisvarnatto)产生的碱性丝氨酸蛋白酶，经研究发现，纳豆激酶具有很好的溶解纤维蛋白(血栓的主要成分)能力。

纳豆激酶比市面上其他治疗血栓的药物，更具有安全、高效、价廉、易得等优点，未来前景十分广阔。然而纳豆激酶在原核表达体系中表达时，表达蛋白不纯且易形成包涵体，不易分离目的蛋白；而在真核体系中表达时，表达量又较低，限制其进一步应用，所以获得纯度高，产量又高的纳豆激酶成为其扩大工业化生产的重中之重。鉴于纳豆激酶功效及发展前景，急需构建一种高效表达纳豆激酶的基因工程菌。

技术实现要素：

本发明的目的是构建一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌。

本发明采用的技术方案是：一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌，为komagataellaphaffiilnf013，于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为cgmccno.22081。

一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌的构建方法，方法包括如下步骤：

1)gap启动子基因片段的获得：

以pgapzα-a质粒为模板，以primer5和primer6为引物，通过pcr反应，获得两端添加酶切位点kpni和noti的gap启动子基因片段；

primer5：ggggtacctttttgtagaaatgtcttggtgtc

primer6：ataagaatgcggccgcatagttgttcaattgattgaa

2)pgapzα-a-nkt2载体质粒的获得：

以pgapzα-a-nkt2为模板，以primer7和primer8为引物，通过环pcr扩增，获得在pgapzα-a-nkt2下游两端添加酶切位点kpni和noti的pgapzα-a-nkt2载体质粒；

primer7：ataagaatgcggccgcttcgaaacgatgagatttcct

primer8：ggggtaccatagttgttcaattgattgaa

3)构建pgapzα-a-gap-gap-nkt2重组表达载体：

将步骤1)获得的两端添加酶切位点kpni和noti的gap启动子基因片段和步骤2)获得的在pgapzα-a-nkt2下游两端添加酶切位点kpni和noti的pgapzα-a-nkt2载体质粒，通过双酶切连接，获得pgapzα-a-gap-gap-nkt2重组表达载体；

4)转化：将pgapzα-a-gap-gap-nkt2重组表达载体转化到毕赤酵母x33中，获得重组基因工程菌komagataellaphaffiilnf013。

优选的，上述的构建方法，步骤1)中，pcr反应的条件为：

pcr反应体系：primer52μl，primer62μl，2×estaqmastermix25μl，pgapzα-a质粒dna1μl，ddh2o补至总体系50μl；

pcr反应条件：94℃预变性2min；94℃30s；55℃30s；72℃30s；25cycles；72℃延伸7min；4℃10min。

优选的，上述的构建方法，步骤2)中，环pcr扩增的条件为：

pcr反应体系：primer72μl，primer82μl，2×estaqmastermix25μl，pgapzα-a-nkt2dna1μl，ddh2o补至总体系50μl；

pcr反应条件：98℃预变性3min；98℃30s；56℃30s；72℃50s；25cycles；72℃延伸7min；4℃10min；

优选的，上述的构建方法，步骤4)中，将pgapzα-a-gap-gap-nkt2重组表达载体，先进行线性化后，再使用电转化法转化到毕赤酵母x33中。

优选的，上述的构建方法，线性化体系为：pgapzα-a-gap-gap-nkt21μg，10×quickcutbuffer2μl，quickcutenzymebglⅱ1μl，ddh2o补至总体系20μl；反应条件为温度37℃，酶切时间为10min-15min。

本发明提供的一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌在表达纳豆激酶中的应用。方法如下：筛选纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌的阳性菌落，接种于含zeocin的bmgy培养基中，在温度28℃，摇床转速220rmp/min下摇床培养，每培养24h向培养基中加入相对于培养基体积1％的甲醇溶液。培养4d后，冷冻离心收集蛋白上清液，为纳豆激酶蛋白rnkt2。所述纳豆激酶蛋白rnkt2氨基酸序列如seqidno.3所示。

本发明的有益效果是：

1、本发明采用基因工程技术，构建了一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌lnf013，该重组基因工程菌能够高效表达纳豆激酶。

2、本发明构建的重组基因工程菌komagataellaphaffiilnf013，可高效表达纳豆激酶，纳豆激酶表达量达到4.461±0.254μg/μl，活性达到355.83±0.564fu/ml，为今后纳豆激酶大规模的应用奠定基础。为探究纳豆激酶在心血管疾病中的作用机制提供了工具，并为开发预防心血管疾病药物奠定基础。

3、启动子是位于结构基因5'端上游的dna序列，能活化rna聚合酶，使之与模板dna准确的结合并具有转录起始的特异性，起始时间和表达的程度。启动子就像“开关”，决定基因的活动。启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录因子的这种蛋白质结合而控制基因活动的。转录因子就像一面“旗子”，指挥着rna聚合酶的活动。这种酶制造着基因的rna复制本，一般分为广谱表达型启动子、组织特异性启动子、肿瘤特异性启动子等多种形式。本发明通过串联gap启动子方法提高纳豆激酶在毕赤酵母x33中的表达。

附图说明

komagataellaphaffiilnf013，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称：cgmcc，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101。保藏日期为2021年3月29日，保藏编号为cgmccno.22081。

图1是重组载体pgapzα-a-gap-gap-nkt2构建图谱。

图2是gap启动子基因片段pcr扩增结果。

其中，m:marker；1：pgapzα-a质粒(阳性对照)；2：无菌水(空白对照)；3：pcr产物gap启动子基因片段；4：pcr产物gap启动子基因片段。

图3是pgapzα-a-nkt2基因片段环pcr扩增结果。

其中，m：marker；1：pgapzα-a-nkt2质粒(阳性对照)；2：无菌水(空白对照)；3：退火温度为55℃下的pcr产物pgapzα-a-nkt(+kpni和noti酶切位点)；4：退火温度为57℃下的pcr产物pgapzα-a-nkt(+kpni和noti酶切位点)；5：退火温度为59℃下的pcr产物pgapzα-a-nkt(+kpni和noti酶切位点)；6：退火温度为61℃下的pcr产物pgapzα-a-nkt(+kpni和noti酶切位点)。

图4是验证pgapzα-a-gap-gap-nkt2重组质粒双酶切结果。

其中，m:marker；1：pgapzα-a-gap-gap-nkt2完整载体；2：pgapzα-a-gap-gap-nkt2双酶切条带pgapzα-a-nkt2+pgap(bglii和kpni酶切位点)；3：pgapzα-a-gap-gap-nkt2双酶切条带pgapzα-a-nkt2+pgap(kpni和noti酶切位点)。

图5是重组载体pgapzα-a-gap-gap-nkt2线性化图谱。

其中，m：marker；1：未线性化质粒pgapzα-a-gap-gap-nkt2；2：线性化质粒pgapzα-a-gap-gap-nkt2；3：线性化质粒pgapzα-a-gap-gap-nkt2。

图6是rnkt2与对比例的sds-page分析柱状图谱。

图7是rnkt2与对比例的活性图谱。

其中，1：pgapzα-a-nkt水解纤维蛋白原形成透明圈；2：rnkt2水解纤维蛋白原形成透明圈；3：构建的pgapzα-a-fld1-nkt2重组质粒表达蛋白水解纤维蛋白原形成透明圈；4：构建的pgapzα-a-gap-fld1-nkt2重组质粒表达蛋白水解纤维蛋白原形成透明圈。

具体实施方式

pgapzα-a-nkt2质粒为本实验室保存的质粒，用于以下试验，其构建方法如下：

1、反复冻融法提取枯草芽孢杆菌dna：

将枯草芽孢杆菌在lb平板培养基上划线过夜培养。挑取单菌落，接种于10mllb液体培养基，180rpm37℃过夜培养。取1ml菌体，100℃水浴10min，之后置于-80℃冰箱10min。重复两次。6000rpm离心5min，取上清液，得到枯草芽孢杆菌dna。

2、获得纳豆激酶前导肽-成熟肽基因片段nkt：

通过对纳豆激酶nkt基因序列比对，分别设计引入酶切位点ecori(gaattc)的primer1以及引入酶切位点xhoi(ctcgag)的primer2。以枯草芽孢杆菌dna为模板，以primer1和primer2为引物，通过pcr方法扩增出nkt基因片段。

nkt基因片段引物：

primer1：5’-gcggaattcggccggaaaaagcagtac-3’

primer2：5’-gcgctcgagttgtgcagctgcttgtac-3

pcr反应条件：94℃预变性2min；94℃30s；53℃30s；72℃30s；30cycles；72℃延伸7min；4℃10min。

将pcr产物按照上海生工股份有限公司生产的pcr产物凝胶回收试剂盒提供的说明书步骤进行操作，所得产物于-20℃保存或直接用于后续实验。

将pcr产物经电泳检测，通过pcr方法获得的nkt基因片段，大小为1050bp，符合纳豆激酶前导肽-成熟肽nkt基因序列，并以其为模板获得突变片段nkt194。

3、获得nkt194突变片段：

以nkt基因片段为模板，通过重叠延伸pcr扩增和连接合成nkt194突变片段。根据纳豆激酶nkt基因序列分别设计引物，并分别引入酶切位点ecori(gaattc)和xhoi(ctcgag)。分别扩增突变的上游片段nkt194f和下游片段nkt194r。

以nkt基因片段为模板，primer1和primer3为引物通过重叠延伸pcr扩增突变的上游片段nkt194f；以nkt基因片段为模板，primer4和primer2为引物通过重叠延伸pcr扩增下游片段nkt194r，通过t4连接酶，16℃过夜连接，将nkt194f和nkt194r连接合成nkt194突变片段。

突变的上游片段nkt194f引物：

primer1：5’-gcggaattcggccggaaaaagcagtac-3’

primer3：5’-agccattacatcaagctctggtcctacgctggagaatg-3’

下游片段nkt194r引物：

primer4：5’-cattctccagcgtaggtccagagcttgatgtaatggct-3’

primer2：5’-gcgctcgagttgtgcagctgcttgtac-3’

pcr反应条件：94℃预变性2min；94℃30s；53℃30s；72℃30s；30cycles；72℃延伸7min；4℃10min。

将pcr产物按照上海生工股份有限公司生产的pcr产物凝胶回收试剂盒提供的说明书步骤进行操作，所得产物与-20℃保存或直接用于后续实验。将pcr产物分别经电泳检测，分别获得nkt194上游和下游突变片段，大小分别为810bp和240bp。确定pcr结果成功。通过t4连接酶过夜连接，获得nkt194突变片段。将所获得的nkt194突变片段的基因序列与blast比对，在846位由t突变为a。证明成功获得nkt194突变片段。

4、密码子优化

将nkt194突变片段和表达质粒pgapzα-a分别在酶切位点ecorⅰ和xhoⅰ进行双酶切，然后t4连接酶连接，构建重组载体pgapzα-a-nkt194。将重组载体pgapzα-a-nkt194送到武汉金开瑞生物工程有限公司，在保持nkt194突变片段的氨基酸序列不变的前提下，将nkt194根据毕赤酵母x33密码子偏爱性对nkt194突变片段基因进行密码子优化和合成，获得优化的基因片段，命名为nkt2。经武汉金开瑞生物工程有限公司检测，优化合成后的nkt2基因序列如seqidno.2所示。

5、构建重组载体pgapzα-a-nkt2

将nkt2和表达质粒pgapzα-a分别在酶切位点ecorⅰ和xhoⅰ进行双酶切，然后t4连接酶连接，构建重组载体pgapzα-a-nkt2。经电泳检测，经过酶切位点ecorⅰ和xhoⅰ进行双酶切后，切下的片段大小为1070bp与nkt2片段大小一致。证明重组载体pgapzα-a-nkt2构建成功。

实施例1一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌

如图1所示，构建方法，包括如下步骤：

1、gap启动子基因片段的获得：

以实验室保藏的pgapzα-a真核表达载体质粒基因组为模板，以primer5和primer6为引物，通过重叠延伸pcr反应，获得两端添加酶切位点kpni和noti的gap启动子基因片段，其大小为507bp。gap启动子的序列如seqidno.1所示。

gap启动子引物序列如下：

primer5：ggggtacctttttgtagaaatgtcttggtgtc

primer6：ataagaatgcggccgcatagttgttcaattgattgaa

pcr反应条件：94℃预变性2min；94℃30s；55℃30s；72℃30s；25cycles；72℃延伸7min；4℃10min。

图2是gap启动子基因片段pcr扩增结果，由图2可见，泳道3和4pcr扩增出含有kpnⅰ、notⅰ酶切位点的gap启动子，片段大小为483bp，与gap启动子大小相同，片段扩增成功。

2、pgapzα-a-nkt2载体质粒的获得：

以实验室保存的pgapzα-a-nkt2载体为模板，以primer7和primer8为引物，通过环pcr扩增，获得在pgapzα-a-nkt2下游两端添加酶切位点kpni和noti的pgapzα-a-nkt2载体质粒，其大小为4162bp。

primer7：ataagaatgcggccgcttcgaaacgatgagatttcc

primer8：ggggtaccatagttgttcaattgattgaa

pcr反应条件：98℃预变性3min；98℃30s；56℃30s；72℃50s；25cycles；72℃延伸7min；4℃10min。

图3是pgapzα-a-nkt2基因片段环pcr扩增结果，由图3可见，泳道3、4、5、6均以pgapzα-a-nkt质粒为模板pcr添加kpnⅰ、notⅰ酶切位点的pgapzα-a-nkt基因片段，但退火温度不同，分别为55℃、57℃、59℃、61℃。pcr扩增的结果片段大小为4156bp，图片结果与预期的结果相同，说明片段扩增成功。

3、构建pgapzα-a-gap-gap-nkt2重组表达载体：

将步骤1获得的两端添加酶切位点kpni和noti的gap启动子基因片段和步骤2获得的在pgapzα-a-nkt2下游两端添加酶切位点kpni和noti的pgapzα-a-nkt2载体质粒，通过双酶切连接，获得pgapzα-a-gap-gap-nkt2重组表达载体。

图4是验证pgapzα-a-gap-gap-nkt2重组质粒双酶切结果。由图4可见，选用bglⅱ与kpnⅰ酶切位点和kpnⅰ与notⅰ酶切位点分别进行双酶切。如图4所示，泳道2和3显示中最上方条带为重组载体双酶切后的载体大小，下方条带大小为483bp，其大小与之前设想的gap启动子片段大小相同，实验结果表明重组载体pgapzα-gap-gap-nkt构建成功。

4、转化：

将pgapzα-a-gap-gap-nkt2重组表达载体，先进行线性化后，再使用电转化法转化到毕赤酵母x33中。

反应条件为：温度37℃，酶切时间为10min-15min。

取3-5μg线性化完成的重组载体加入80μl毕赤酵母x33感受态细胞中，在冰上将二者混匀；将所得混合物加到转化电极杯的底部，将电击杯放到冰上冰置大约5min，之后进行电转；电击完成产物加入1ml1m山梨醇溶液重悬混合物，将电击杯中混合物转移至灭菌的ep管中，随后加入500μl灭菌完成的ypd液体培养基；将ep管放入摇床震荡培养，培养后6000rpm/min离心5min，吸取上清液，剩余上清液用移液枪将菌体吹打混匀后涂布在含zeocin的ypd固体培养基，直至平板上无明显肉眼可见水迹。筛选阳性菌落进行pcr验证，获得pcr验证成功的阳性菌落，命名为komagataellaphaffiilnf013。

图5是重组载体pgapzα-a-gap-gap-nkt2线性化图谱，由图5可见，为了重组载体中的目的基因整合到真核基因组中，经重组质粒进行双酶切。泳道2、3经过单酶切之后，出现单一线性条带，证明线性化成功。

实施例2纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌的应用

1、重组基因工程菌表达纳豆激酶：

将重组基因工程菌komagataellaphaffiilnf013重新划线ypd固体培养基，37℃培养3-4d。挑取平板上的单菌落接种于100ml含zeocin的bmgy培养基中，摇床培养；表达温度为28℃，摇床转速220rmp/min，每培养24h向培养基中加入相对于培养基体积1％的甲醇溶液。培养4d后，冷冻离心，收集蛋白上清液，即为纳豆激酶蛋白，命名为纳豆激酶rnkt2。

经武汉金开瑞生物工程有限公司检测，纳豆激酶rnkt2氨基酸序列如seqidno.3所示。

对比例：以本实验室保存的pgapzα-a-nkt2质粒为模板，按实施例1的方法构建了pgapzα-a-fld1-nkt2重组载体、pgapzα-a-gap-fld1-nkt2重组载体，同时以pgapzα-a-nkt2质粒为空白。将重组载体电转化到毕赤酵母x33感受态细胞中，构建重组工程菌株。按上述同样的方法，同样表达纳豆激酶蛋白。

2、测定rnkt2表达量：

利用bca蛋白试剂盒测定纳豆激酶蛋白表达量。

图6是本发明重组基因工程菌komagataellaphaffiilnf013表达纳豆激酶蛋白与对比例表达的纳豆激酶蛋白的sds-page分析柱状图谱。由图6可见，本发明重组基因工程菌komagataellaphaffiilnf013表达的纳豆激酶rnkt2表达量达到4.461±0.254μg/μl，表达量显著提高。

3、测定rnkt2活性：

利用日本纳豆激酶协会活性测量方法改良测定纳豆激酶蛋白的活性。一个酶活力单位(fu)定义为：在特定条件下(37℃，ph8.0)每分钟在275nm处的吸光值变化0.01所需要的酶量。

酶活性，fu/g＝fu/ml×2ml/g

图7是本发明重组基因工程菌komagataellaphaffiilnf013表达的纳豆激酶蛋白与对比例表达的纳豆激酶蛋白的活性图谱。由图7可见，本发明重组基因工程菌表达的纳豆激酶rnkt2的活性达到355.83±0.564fu/ml。pgapzα-a-nkt表达的纳豆激酶蛋白的酶活性为220.15±3.46fu/ml，pgapzα-a-fld1-nkt2表达的纳豆激酶蛋白的酶活性为315.76±5.31fu/ml，pgapzα-a-gap-fld1-nkt2表达的纳豆激酶蛋白的酶活性为280.83±1.89fu/ml。

<110>辽宁大学

<120>一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌及其构建方法和应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>483

<212>dna

<213>gappromoterregion

<400>1

agatcttttttgtagaaatgtcttggtgtcctcgtccaatcaggtagcca50

tctctgaaatatctggctccgttgcaactccgaacgacctgctggcaacg100

taaaattctccggggtaaaacttaaatgtggagtaatggaaccagaaacg150

tctcttcccttctctctccttccaccgcccgttaccgtccctaggaaatt200

ttactctgctggagagcttcttctacggcccccttgcagcaatgctcttc250

ccagcattacgttgcgggtaaaacggaggtcgtgtacccgacctagcagc300

ccagggatggaaaagtcccggccgtcgctggcaataatagcgggcggacg350

catgtcatgagattattggaaaccaccagaatcgaatataaaaggcgaac400

acctttcccaattttggtttctcctgacccaaagactttaaatttaattt450

atttgtccctatttcaatcaattgaacaactat483

<210>2

<211>1068

<212>dna

<213>nkt2

<400>2

gaattcgctggtaagtcctccaccgagaagaagtacatcgttggtttcaagcagactatg60

tccgctatgtcctccgctaagaagaaggacgttatctccgagaaaggtggtaaggtccag120

aagcagttcaagtacgttaacgctgctgctgctactttggacgagaaggctgtcaaagag180

ttgaagaaggatccatccgttgcctacgttgaagaggaccatattgctcacgaatacgct240

cagtctgtcccatacggtatttcccagattaaggctccagccttgcactcccaaggttac300

actggttctaacgttaaggttgccgttatcgactccggtatcgattcttctcacccagac360

ttgaacgttagaggtggtgcttctttcgttccatccgagactaacccataccaagatggt420

tcttcccacggtactcatgttgctggtactatcgctgctctgaacaactccattggtgtt480

ttgggtgttgctccttccgcttccttgtacgctgttaaggttttggactctactggttcc540

ggtcagtactcctggattatcaacggtattgagtgggccatctccaacaacatggacgtc600

attaacatgtcccttggtggtccaactggttccactgctcttaagactgttgttgacaag660

gctgtctcctccggtattgtcgttgctgctgcagctggtaacgaaggttcttctggttct720

acttccaccgttggttacccagctaagtacccatccactattgctgttggtgctgtcaac780

tcttccaaccagagagcttctttctcttccgtcggttccgaattggatgttatggctcca840

ggtgtttccatccagtctactttgccaggtggtacttacggtgcttacaacggtacttct900

atggctactccacacgttgctggtgctgctgccttgattttgtctaagcacccaacttgg960

actaacgcccaggttagagacagattggaatccactgcaacctacctgggtaactccttc1020

tactacggtaagggtttgatcaacgttcaggctgctgctcaatctaga1068

<210>3

<211>466

<212>prt

<213>rnkt2

<400>3

metargpheproserilephethralavalleuphealaalaser

151015

seralaleualaalaprovalasnthrthrthrgluaspgluthr

202530

alaglnileproalaglualavalileglytyrseraspleuglu

354045

glyasppheaspvalalavalleupropheserasnserthrasn

505560

asnglyleuleupheileasnthrthrilealaserilealaala

657075

lysglugluglyvalserleuglulysargglualaglualaglu

808590

phealaglylysserserthrglulyslystyrilevalglyphe

95100105

lysglnthrmetseralametserseralalyslyslysaspval

110115120

ileserglulysglyglylysvalglnlysglnphelystyrval

125130135

asnalaalaalaalathrleuaspglulysalavallysgluleu

140145150

lyslysaspproservalalatyrvalglugluasphisileala

155160165

hisglutyralaglnservalprotyrglyileserglnilelys

170175180

alaproalaleuhisserglnglytyrthrglyserasnvallys

185190195

valalavalileaspserglyileaspserserhisproaspleu

200205210

asnvalargglyglyalaserphevalprosergluthrasnpro

215220225

tyrglnaspglyserserhisglythrhisvalalaglythrile

230235240

alaalaleuasnasnserileglyvalleuglyvalalaproser

245250255

alaserleutyralavallysvalleuaspserthrglysergly

260265270

glntyrsertrpileileasnglyileglutrpalaileserasn

275280285

asnmetaspvalileasnmetserleuglyglyprothrglyser

290295300

thralaleulysthrvalvalasplysalavalserserglyile

305310315

valvalalaalaalaalaglyasngluglyserserglyserthr

320325330

serthrvalglytyrproalalystyrproserthrilealaval

335340345

glyalavalasnserserasnglnargalaserpheserserval

350355360

glysergluleuaspvalmetalaproglyvalserileglnser

365370375

thrleuproglyglythrtyrglyalatyrasnglythrsermet

380385390

alathrprohisvalalaglyalaalaalaleuileleuserlys

395400405

hisprothrtrpthrasnalaglnvalargaspargleugluser

410415420

thralathrtyrleuglyasnserphetyrtyrglylysglyleu

425430435

ileasnvalglnalaalaalaglnserarggluglnlysleuile

440445450

serglugluaspleuasnseralavalasphishishishishis

455460465

his

466