一种农杆菌介导真空侵染木豆的高效遗传转化方法与流程

本发明属于分子生物学与植物转基因技术领域，具体地涉及一种利用农杆菌介导真空侵染木豆植株的高效遗传转化方法及其应用，能够获得稳定转化的转基因根和瞬时转化的叶片。

背景技术：

木豆原产于印度，是世界第六大食用豆类，是半干旱地区主要的经济作物，具有较高的营养价值和药用价值。近年来，随着木豆的药用价值不断被开发，种植范围也不断扩大。以传统方法栽培木豆已经无法满足市场需求，如何通过分子手段培育高产量高质量的木豆成为人们关注的问题，同时相关的科学研究也在不断展开。然而相比于水稻，玉米，大豆等草本植物，木豆作为木本植物，要通过组织细胞的遗传转化方法一直都是基因工程中的难点。目前关于木豆遗传转化方法的报道极少，本发明主要借鉴了大豆等相近物种的遗传转化方法。在此前，有利用发根农杆菌k599介导真空渗透大豆种子下胚轴而获得转基因毛状根的遗传转化方法。但该方法存在转化根和正常根同时存在，不好区分的问题。而本发明不仅可以在木本植物中获得转化根，同时可以排除原始根的干扰。本发明的优势还在于无菌条件下高效快速的获得大量转基因根组织，以及保留复合体转基因木豆植株。该方法是用农杆菌侵染木豆全株，因此地上部分的基因瞬时表达可以应用于基因功能的快速验证。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种高效、快速、稳定的农杆菌介导真空侵染木豆的高效遗传转化方法，通过木豆种子筛选，无菌培养长成茁壮木豆苗后，取木豆全株浸没于农杆菌侵染液中，在压力条件下进行真空侵染；侵染过后洗苗移栽到新的抗性ms培养基中培养，等待在茎部长出新根；待出新根后剪去旧根，洗苗移栽至新的ms培养基等待转基因新根生长；或待长出新根后直接全株移栽至育苗土中，等待新根生长茁壮后再截去旧根。与此同时，运用相同的真空侵染方法后培养3-7天的木豆苗的叶片可用于基因表达量的验证。同时该方法的优点还包括操作步骤简单，并能够获得无菌的转基因材料，解决木豆遗传转化周期长，效率低等问题，该方法可以跳过愈伤再生等步骤，直接由茎部获得转基因根系，同时地上部分可用于基因瞬时表达的快速验证。

为实现上述目的，改善目前木豆遗传转化技术的薄弱现状，本发明所采取的技术方案具体如下：

一种农杆菌介导真空侵染木豆的高效遗传转化方法，包括：

步骤1、外植体筛选，消毒及无菌培养；

步骤2、农杆菌侵染液的制备；

步骤3、木豆全株真空渗透；

步骤4、叶片与根部鉴定。

在上述方案的基础上，步骤1外植体筛选，消毒及无菌培养的具体步骤包括：

步骤1.1、木豆选用已有全基因组测序数据的品种“icpl87119”，木豆种子挑选颗粒饱满匀称，状态健康的种子，以提高出苗率和降低染菌率；

步骤1.2、采用次氯酸钠消毒法对筛选出的木豆种子进行消毒；

步骤1.3、在超净台中将消毒后的木豆种子接种于ms固体培养基中，然后置于人工培养室条件下生长，等待生长20-30天，挑选健壮且生长一致(株高相近，具有5片叶片的时期)的木豆植株，备用。

在上述方案的基础上，步骤1.2中具体的消毒过程为：75％酒精消毒30秒，再用次氯酸钠消毒6分钟，最后用无菌水冲洗5次。

在上述方案的基础上，步骤1.3中木豆种子消毒后萌发到成苗的阶段都是在人工培养室的组培瓶中进行，保证无菌环境；

待侵染的木豆苗选用培养生长20-30天的苗，其中以25天木豆苗作为材料的转基因成功率最高。

在上述方案的基础上，步骤2农杆菌侵染液制备的具体步骤包括：

步骤2.1、将包含有植物过表达载体35s-egfp-prok2的农杆菌gv3101于yep+rif+kana固体培养基上划线接种，置于28℃培养箱倒置培养48h；

步骤2.2、挑单菌落于5mlyep+rif+kana液体培养基中，置于28℃摇床培养12h，转速200rpm；

步骤2.3、将5ml菌液转入150mlyep+rif+kana液体培养基中，置于28℃摇床培养6h，转速200rpm，使od600吸光值在3-5之间；

步骤2.4、5000rpm离心10分钟，去上清后沉淀重悬于300ml普通ms液体培养基(ph5.8)中，使od600吸光值在0.3-2.4之间，备用。

在上述方案的基础上，步骤2.1中所述的包含有植物过表达载体35s-egfp-prok2的农杆菌gv3101是通过常规gv3101农杆菌冻融法将35s-egfp-prok2质粒转入农杆菌gv3101感受态获得的。

在上述方案的基础上，yep+rif+kana培养基指具有100mg/l硫酸卡那霉素和500mg/l利福平的yep培养基。

在上述方案的基础上，农杆菌侵染液是选择od600在0.3-2.4之间的侵染液，其中以od600在2.4的侵染液侵染后的根部转基因效率高，以od600在1.2的侵染液侵染后的叶片转化效率高；且侵染液以ms培养基为基础，既不影响农杆菌侵染活性，又可降低木豆侵染后的伤害程度。

在上述方案的基础上，步骤3木豆全株真空渗透的具体步骤包括：

步骤3.1、将状态良好的木豆植株浸没于农杆菌侵染液中，在0.03-0.09mpa真空压力条件下侵染5分钟；

步骤3.2、真空侵染后洗苗，于滤纸上除去表面水分，最后置于含有100mg/l头孢素的ms培养基中；

步骤3.3、将侵染后的木豆植株置于人工培养室条件下生长10至15天，在茎下部发出新根；

步骤3.4、侵染后的木豆植株可在培养3-7天之间取叶片部位用于基因瞬时表达的快速鉴定。

在上述方案的基础上，真空侵染后叶片部位的取样时间在培养5天，此时是木豆苗状态最好且基因表达量最高的时间段。

在上述方案的基础上，步骤3.1中所述浸没是指在一个1l烧杯中加入300ml的侵染液，将木豆整株浸泡在液面以下，且一次性可在烧杯中放入20株苗左右，若加大烧杯和侵染液规格，则相应株数也可增加，在不伤害植株的条件下保证植株浸没即可。

在上述方案的基础上，步骤3.1中压力值设定在0.07mpa时根部转基因效率高，压力值设定在0.05mpa时叶片转化效率高，且对木豆叶片的伤害程度相对较低。

在上述方案的基础上，步骤3.2中所述洗苗是为了除去植物表面在瞬转时残留的农杆菌，具体操作为：先用无菌水洗一次，125mg/l头孢抗性无菌水洗一次，最后无菌水洗三次。

在上述方案的基础上，所述的人工培养室条件为温度25±2℃，光照16小时，黑暗8小时的循环周期。

在上述方案的基础上，步骤4叶片与根部鉴定的具体步骤包括：

步骤4.1、取步骤3.4中所述的培养3-7天后的木豆叶片组织冻于液氮中，用ctab法提取rna，反转录为cdna后用荧光定量方法鉴定基因表达量变化；

步骤4.2、将步骤3.3中所述生长10至15天后发出新根的木豆植株截去旧根，置于新的ms培养基中继续生长；或者将步骤3.3中所述生长10至15天后发出新根的木豆全株移栽到育苗土中，等待新根生长茁壮后再除去旧根；

步骤4.3、待新根生长一段时间后，剪取部分分生的侧根冻于液氮中，待dna检测鉴定；

步骤4.4、将步骤4.3中获得的根部组织用ctab法提取dna，用35s+egfp基因的全长引物进行pcr扩增，若pcr扩增出大小为720bp的目的条带，且测序结果比对为35s+egfp基因序列，而未侵染的木豆植株根部未能扩增出任何条带，表明茎下部发出的新根为转基因不定根。

在上述方案的基础上，步骤4.2中所述新的ms培养基是指添加50mg/l头孢素的ms培养基，且在培养基冷却但未凝固时将剪去旧根的发出新根苗移入。

有益效果：

本发明所述的杆菌介导真空侵染木豆的高效遗传转化不仅可以在木本植物中获得转化根，同时可以排除原始根的干扰。本发明的优势还在于无菌条件下高效快速的获得大量转基因根组织，以及保留复合体转基因木豆植株。该方法是用农杆菌侵染木豆全株，因此地上部分的基因瞬时表达可以应用于基因功能的快速验证。

附图说明

本发明有如下附图：

图1真空转染到最终获得具有转基因根的全过程示意图。其中，(a)待侵染的农杆菌先在平板划线，15ml离心管小摇，最后大摇转至ms培养基中制成侵染液示意图；(b)使用真空泵进行真空辅助侵染示意图；(c)侵染后木豆在茎部长出新根示意图；(d)出新根的木豆截去旧根后转移至新的组培瓶中示意图；(e)出新根的木豆截去旧根后转移至土壤中示意图；(f)具有转化根的木豆植株在组培瓶中根系逐渐发达示意图。

图2真空侵染后在茎部出根的细节图。(a)(b)(c)不同苗龄的木豆植株被侵染后在茎部出新根的整体图；(d)(e)(f)不同苗龄的木豆植株被侵染后在茎部出新根的局部细节图，分别对应(a)(b)(c)植株的出新根部位。

图3在激光共聚焦显微镜下过表达egfp蛋白的转化根被激发出荧光的示意图，(a)(b)为普通根，(c)(d)为转化根；

图4不同压强，侵染时间和侵染液浓度下木豆叶片的损伤程度和基因相对表达量示意图。图片(左)是木豆叶片损伤程度通过台盼蓝染色后实际示意图，柱形图(右)分别为以imagej软件对染色程度进行定量分析和叶片瞬时侵染后的荧光定量分析示意图。

具体实施方式

以下结合附图1-4对本发明作进一步详细说明。

我们基于以上建立的遗传转化方法设计具体实施例。本次的应用案例是构建标记基因egfp的过表达载体，通过该方法获得过表达egfp基因的根系，结合pcr测序和激光共聚焦显微分析加以验证，同时在叶片部分运用台盼蓝染色和荧光定量测定基因瞬时转化后的表达效率。下面结合实施例展开对各步骤的详细描述：

(1)木豆种子挑选，消毒及无菌培养

选用颗粒饱满匀称且没有虫眼的木豆种子采用次氯酸钠消毒法，具体消毒过程为75％酒精消毒30秒，再用次氯酸钠消毒6分钟，最后用无菌水冲洗5次；在超净台中将消毒后种子接种于ms固体培养基中，置于人工培养室条件下生长，等待生长25天后挑选健壮且生长一致的木豆植株，备用。

(2)农杆菌侵染液的制备，木豆全株真空渗透

将携带过表达载体35s-egfp-prok2的农杆菌gv3101于yep+rif+kana固体培养基上划线接种，置于28℃培养箱倒置培养48h；挑单菌落于5mlyep+rif+kana液体培养基中，置于28℃摇床培养12h，转速200rpm；将5ml菌液转入150mlyep+rif+kana液体培养基中，置于28℃摇床培养6h，转速200rpm，使od600达到4左右；5000rpm离心10分钟，去上清后沉淀重悬于300ml普通ms液体培养基(ph5.8)中，基于以上步骤分别配制od600为1.2和2.4的侵染液。将状态良好的木豆植株分别浸没于两种浓度的农杆菌侵染液中，其中浸没于od600为1.2的侵染液中的木豆苗在0.05mpa真空压力条件下侵染5分钟，浸没于od600为2.4的侵染液中的木豆苗在0.07mpa真空压力条件下侵染5分钟；真空侵染后用无菌水冲洗木豆，于滤纸上尽量除去表面水分，最后置于含有100mg/l头孢素的ms培养基中；以od600为1.2且压力值为0.05mpa条件下侵染的木豆苗用于叶片部位瞬时转化的测定，在侵染5天后取样冻于液氮，保存于-80℃用于基因表达量鉴定；以od600为2.4且压力值为0.07mpa条件下侵染的木豆苗用于根部稳定转化的鉴定，在侵染后置于人工培养室条件下生长10至15天会在茎下部发出新根。

基于以上实验流程，探究不同条件对木豆叶片瞬时转化效率的影响，包括真空压力值，侵染后取样时间和侵染液浓度三个指标的测定。针对真空压力值设置0.03、0.05、0.07、0.09mpa进行上述侵染过程，结果发现压力值设定在0.05mpa时叶片转化效率相对高，且对木豆叶片的伤害程度相对较低；针对侵染后取样时间设置3天，5天，7天进行取样鉴定，结果发现在5天时取样的叶片转化效率相对高，且对木豆叶片的伤害程度相对较低；针对侵染液浓度设置od600吸光值分别为0.3、0.6、1.2、2.4的侵染液进行上述侵染过程，结果发现侵染液浓度在od600为1.2时叶片转化效率相对高，且对木豆叶片的伤害程度相对较低，具体如图4所示。

基于以上实验流程，探究不同条件对木豆根部稳定转化效率的影响，包括木豆苗龄，侵染液浓度和真空压力值三个指标的测定。针对苗龄设置20天，25天，30天的木豆植株进行上述侵染过程，结果发现25天的木豆苗的出根率和转化率相对最高，具体如表一所示；针对侵染液浓度设置od600吸光值分别为0.6、1.2、2.4的侵染液进行上述侵染过程，结果发现侵染液浓度在od600为2.4时木豆苗的出根率和转化率相对最高，具体如表二所示；针对真空压力值设置0.05、0.07、0.09mpa进行上述侵染过程，结果发现真空压力值在0.07mpa时木豆苗的出根率和转化率相对最高，具体如表三所示。

表一一定压强和侵染液浓度下木豆不同苗龄对转化率的影响

其中，染菌率指同苗龄植株受真菌污染的比例，出根率指未污染的健康植株中出根的比例，转化率指出根的植株中成功转化的植株比例。

表二一定压强和苗龄下木豆不同侵染液浓度对转化率的影响

其中，侵染液浓度以od600下的吸光值表示。

表三一定苗龄和侵染液浓度下木豆不同压强对转化率的影响

(3)叶片与根部鉴定

将保存于-80℃的不同条件瞬转的叶片用液氮研磨成粉末后，ctab法提取rna，反转录到cdna后荧光定量鉴定。在叶片瞬时转化实验中设置对照组和实验组，比较不同条件下基因表达量的变化，具体结果如图4所示。将有发出新根的木豆植株截去旧根，置于新的ms培养基中继续生长，也可将发有新根的木豆全株移栽到育苗土中，等待新根生长茁壮后再除去旧根；待新根生长一段时间后，剪取部分分生的侧根冻于液氮，将获得的根部组织用ctab法提取dna，用35s+egfp基因的全长引物进行pcr扩增，若pcr扩增出大小为720bp的目的条带，且测序结果比对为egfp基因序列，而野生型根未能扩增出任何条带，表明茎下部发出的新根为转基因根。同时将测序正确的转基因根置于激光共聚焦显微镜下观察egfp荧光，再次验证是否为转基因根，结果如图3所示。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。