一种CHO细胞内源性的温度敏感型启动子及其应用的制作方法

技术特征：

1.一种cho细胞内源性的温度敏感型启动子，其特征在于：包括核苷酸序列如seqidno.1所示的cirp-p867启动子、核苷酸序列如seqidno.2所示的cirp-p2588启动子和核苷酸序列如seqidno.3所示的pdi-p598启动子中的至少一种。

2.权利要求1所述的cho细胞内源性的温度敏感型启动子在蛋白表达中的应用。

3.一种重组慢病毒载体，其特征在于：包括权利要求1所述的cho细胞内源性的温度敏感型启动子和慢病毒载体骨架。

4.根据权利要求3所述的重组慢病毒载体，其特征在于：所述的慢病毒载体骨架为含tet-off或tet-on启动子级联放大系统的慢病载体。

5.根据权利要求4所述的重组慢病毒载体，其特征在于：所述的重组慢病毒载体为将权利要求1所述的cho细胞内源性的温度敏感型启动子插入含tet-off或tet-on启动子级联放大系统的慢病载体中的tta或rtta表达元件的上游。

6.根据权利要求4或5所述的重组慢病毒载体，其特征在于：所述的含tet-off或tet-on启动子级联放大系统的慢病载体包括但不限于：ptet-ires-egfp、ptet-off、ptet-on、plut-off和plut-off-egfp载体中的至少一种。

7.权利要求4～6任一项所述的重组慢病毒载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤：以含tet-on/off启动子级联放大系统的慢病毒载体为骨架，将目的蛋白基因插入载体多克隆位点，然后将权利要求1所述的cho细胞内源性的温度敏感型启动子插入慢病毒载体中以驱动tta或rtta表达元件进行表达，得到重组慢病毒载体。

8.根据权利要求7所述的重组慢病毒载体的构建方法，其特征在于：

所述的目的蛋白包括但不限于rfp、gfp及其突变系、荧光素酶、fc融合蛋白、hsa融合蛋白和单克隆抗体中的至少一种。

9.权利要求4～6任一项所述的重组慢病毒载体在制备高效表达稳定细胞株中的应用。

10.一种利用慢病毒感染法构建高效表达稳定细胞株的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(a)将权利要求4～6任一项所述的重组慢病毒载体进行慢病毒包装，得到病毒液；

(b)将获得的病毒液感染宿主细胞，得到高效表达稳定细胞库；当需要获得高效表达稳定的细胞株时，对细胞库进一步筛选，即可得到高效表达稳定的细胞株。

11.根据权利要求10所述的利用慢病毒感染法构建高效表达稳定细胞株的方法，其特征在于：

步骤(b)中所述的宿主细胞为cho细胞；进一步为cho-s细胞、cho-dg44细胞或cho-k1细胞。

12.一种cho细胞内源性的温度敏感型启动子的筛选方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)以cirp和pdi翻译起始位点上游的启动子区域为研究对象，生物信息学方法分析并选择置信度较高的基因片区作为假想启动子；

(2)设计引物，从cho细胞基因组中克隆出假想启动子，并将假想启动子插入慢病毒载体中，获得分别由上述假想启动子间接驱动目的蛋白基因表达的重组慢病毒载体；

(3)通过慢病毒感染技术，将步骤(2)所述的慢病毒重组载体转入cho细胞中进行表达，获得慢病毒感染细胞库；

(4)取步骤(3)中获得的慢病毒感染细胞库，进行低温诱导实验，比较细胞库中不同的cho内源启动子在37℃和32℃温度条件下的表达活性及不同启动子在亚生理低温条件下的低温诱导表达水平；

(5)取步骤(3)中获得的慢病毒感染细胞库，进行稳定传代实验，探讨不同启动子的表达稳定性；

(6)综合步骤(4)和步骤(5)的实验结果，得到cho细胞内源性的温度敏感型启动子。

技术总结
本发明公开了一种CHO细胞内源性的温度敏感型启动子及其应用。该启动子包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的CIRP‑P867启动子、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的CIRP‑P2588启动子和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的PDI‑P598启动子中的至少一种。该启动子具有如下优点：CHO内源性、无CpG岛、表达活性高且稳定、低温诱导水平高。因此，该启动子可用于蛋白表达。

技术研发人员：韦苏珍;李靖;曹春来;贺华
受保护的技术使用者：珠海联邦制药股份有限公司
技术研发日：2020.01.03
技术公布日：2021.07.06