大豆花药、胚珠及根冠特异启动子GmFTL2及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体地，涉及一种大豆花药、胚珠及根冠特异启动子GmFTL2及其应用。

背景技术：

启动子是基因中重要的顺式作用元件，一般位于转录起始位点上游几十个碱基处。根据转录模式不同可将启动子分为三种：组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子。组织或器官特异性启动子的活性是受特定的组织细胞结构和化学、物理信号诱导调节的，即这类启动子的表达具有特定的时空性。在这类启动子的驱动下，基因的表达往往只限于某些特定的器官或组织部位或特定的发育时期。组织或器官特异性启动子不仅能使目的基因的表达产物在一定器官或组织部位积累，提高区域表达量，同时也可以避免目标基因在其他组织器官中表达造成的不利影响。

目前为止，已有大量的组织或器官特异性启动子被分离出来，其中包括花特异启动子和种子特异启动子。如花粉发育有关的组织特异性启动子如TA29、Lat52、Osg6B、Zm13、S1等已有详细研究报道；UBC6启动子(Watts，1994)主要在花中表达；Tsp1是水稻中绒毡层特异启动子(马沁沁，2005)；DefH9是子房特异启动子(Rotino，1997)；PtNIP1是柏树胚胎发育特异性启动子(Vincent，2002)。这些启动子都能特异启动目标基因的表达，改变特异组织器官的发育。但在大豆的花药、胚珠及根冠中特异表达的启动子鲜有报道。

成花过程是植物从营养生长向生殖生长的关键转折期，包括开花诱导、花的发端和花器官发育三个阶段，受众多基因调控。在拟南芥中FT(Flowering Locus T)基因是成花素基因，在诱导植物成花的过程中起着重要的作用，然而大豆中FT有6个以上的同源基因，这些基因功能冗余还是否存在功能分化尚未知晓，因此有必要研究和获得调控大豆FT同源基因的启动子序列，从而为深入研究大豆成花过程及其它发育过程提供有效手段和途径。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种来自大豆的组织或器官特异性启动子GmFTL2，从而为在各种作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等植物的花药、胚珠及根冠中特异表达目标基因提供有效途径。

为了实现本发明目的，本发明提供一种大豆花药、胚珠及根冠特异启动子GmFTL2，其核苷酸序列为：

i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有相同功能的核苷酸序列；或

iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且具有相同功能的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的核苷酸序列。

应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的启动子序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸，得到所述启动子GmFTL2的突变序列。例如，将第70位的G取代为C、将第2507位的A取代为T、将第3719位的T取代为A、将第8378位的T取代为A。

本发明还提供含有所述启动子GmFTL2的表达盒。

本发明还提供含有所述启动子GmFTL2的载体。

携带有所述目的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中(Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第411-463页；Geiserson和Corey，1998，Plant Molecular Biology，2^nd Edition)。

本发明还提供含有所述启动子GmFTL2的转基因细胞系、工程菌。

本发明还提供所述启动子GmFTL2在调控下游基因表达中的应用。优选地，下游基因为GUS基因。

本发明还提供所述启动子GmFTL2在制备转基因植物中的应用。

本发明还提供所述启动子GmFTL2在植物花及根发育调节中的应用。

本发明所述植物包括拟南芥、大豆等。

本发明的启动子GmFTL2是采用的是分段克隆的方法从大豆中克隆得到的，共使用5对特异性引物进行PCR扩增，包括(SEQ ID NO:2-11)：

GmFTL2-1-F：5’-GAGAGGTCGACCATGTAAAACCTTCATTGTACTTCT-3’

GmFTL2-1-R：5’-AAGCCGCCAACGTTATAT-3’；

GmFTL2-2-F：5’-ACAATGCATCAATATATATAACGTT-3’

GMFTL2-2-R：5’-TCTAGAAATAAAAATGAAAAAAATA-3’；

GmFTL2-3-F：5’-TAAGGGAGCCAAAATCCAAACAATA-3’

GmFTL2-3-R：5’-TTTGTAAGTCCACCTGAACCTCCAC-3’；

GmFTL 2-4-F：5’-TCAGCTAGTGCCCGTTACAG-3’

GmFTL 2-4-R：5’-CTAGTGTTTTCTCCCTTC-3’；

GmFTL 2-5-F：5’-GTCTAAGTCGATCACCT-3’

GmFTL2-5-R：5’-TCTATGCGCAAACTAACTCACACACTTC-3’。

本发明首次公开了大豆花药、胚珠及根冠特异启动子GmFTL2，利用启动子GmFTL2在拟南芥中过表达GUS基因，结果表明启动子GmFTL2可明显促进植物花药、胚珠和根冠中GUS基因的表达量，因而，GmFTL2启动子在植物花药、胚珠和根冠中具有特异性，适合在各种作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等植物的花药、胚珠和根冠中特异表达目标基因。

附图说明

图1为本发明实施例1中大豆特异启动子GmFTL2的PCR扩增结果；其中，A为5对引物的扩增区段示意图，B为5对引物PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳结果；A和B中，I、II、III、IV和V分别对应于引物GmFTL2-1-F/R、GmFTL2-2-F/R、GmFTL2-3-F/R、GmFTL 2-4-F/R和GmFTL 2-5-F/R。

图2为本发明实施例1中入门载体PEC的结构示意图。

图3为本发明实施例2中入门载体GEC的结构示意图。

图4为本发明实施例2中表达载体BDV2的结构示意图。

图5为本发明实施例2中pGmFTL2::GUS转化拟南芥在花药(A、B)和胚珠(C)中的表达结果。

图6为本发明实施例2中pGmFTL2::GUS转化拟南芥在根冠中的表达结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1大豆花药、胚珠及根冠特异启动子GmFTL2的获得

利用如下5对引物从大豆基因组中分段PCR扩增并酶切连接至入门载体PEC(图2)(见Xu W et al.,BMC Plant Biology:BioVector,a flexible system for gene specific-expression in plants)，测序获得总长度为9978bp的GmFTL2启动子，如图1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

所用引物序列如下：

GmFTL2-1-F：5’-GAGAGGTCGACCATGTAAAACCTTCATTGTACTTCT-3’

GmFTL2-1-R：5’-AAGCCGCCAACGTTATAT-3’；

GmFTL2-2-F：5’-ACAATGCATCAATATATATAACGTT-3’

GMFTL2-2-R：5’-TCTAGAAATAAAAATGAAAAAAATA-3’；

GmFTL2-3-F：5’-TAAGGGAGCCAAAATCCAAACAATA-3’

GmFTL2-3-R：5’-TTTGTAAGTCCACCTGAACCTCCAC-3’；

GmFTL 2-4-F：5’-TCAGCTAGTGCCCGTTACAG-3’

GmFTL 2-4-R：5’-CTAGTGTTTTCTCCCTTC-3’；

GmFTL 2-5-F：5’-GTCTAAGTCGATCACCT-3’

GmFTL2-5-R：5’-TCTATGCGCAAACTAACTCACACACTTC-3’。

PCR扩增体系为：(20μl体系)

PCR反应程序：98℃5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃2min30sec，共25个循环；72℃10min。

实施例2大豆特异启动子GmFTL2在调控下游基因GUS表达中的应用

PCR克隆得到GmFTL2启动子后，通过酶切连接至入门载体PEC，同时将GUS基因酶切连接至另一入门载体GEC，采用GateWay重组克隆的方法(Invitrogen)，通过LR反应将启动子及GUS基因重组至表达载体BDV2上。入门载体GEC、表达载体BDV2见Xu W et al.,BMC Plant Biology:BioVector,a flexible system for gene specific-expression in plants。质粒GEC、BDV2的结构分别如图3、图4所示。获得双元表达载体pGmFTL2::GUS；将植物表达载体pGmFTL2::GUS转化至大肠杆菌DH5α中扩繁。大肠杆菌感受态细胞的转化方法包括：(1)制备含氨苄青霉素的LB固体培养基；(2)取出贮存于-80℃的感受态细胞，冰浴中融化后，加入2μl质粒轻轻混匀，冰浴中放置30分钟；(3)42℃热激30秒，然后立即置于冰浴中3分钟；加入300μl不含抗生素的LB液体培养基，37℃摇床振荡培养1小时(160rpm)；(4)取适量培养液均匀涂于选择性培养基上，37℃倒置培养16小时，用灭菌牙签挑取5-10个(或更多)菌落，置于200μl选择性液体LB培养基中摇菌培养；(5)PCR检测筛选到的阳性克隆。通过农杆菌介导转化方法，将pGmFTL2::GUS转入拟南芥，获得转化pGmFTL2::GUS的拟南芥2株；通过GUS活性分析表明，GmFTL2启动子在植物的花药(图5A、B)、胚珠(图5C)及根冠(图6)中特异表达，可用于包括各种作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等在内的各种植物的花药、胚珠及根冠中中特异表达目标基因。

拟南芥GUS染色方法如下：

(1)将组织样品加入90％丙酮中，置于冰上20～30分钟；

(2)经丙酮处理后，用50mM磷酸缓冲液(pH7.2)、2mM K₄Fe[CN]₆及2mM K₃Fe[CN]₆溶液润洗组织；

(3)将样品放在X－Gluc染色液(50mM磷酸缓冲液(pH7.0),1mM X-gluc,2mM K₄Fe[CN]₆,2mM K₃Fe[CN]₆)中，抽气10分钟，然后37℃染色过夜；

(4)次日用70％乙醇脱色；

(5)在载玻片上加几滴HCG溶液，将脱色后的样品置于其中；

(6)压片，透明15分钟或者过夜透明(根据组织的发育时期而定)。

X-Gluc染色液的配制如下：

①20mM X-gluc母液的配制：

可用DMSO或N,N-二甲基甲酰胺溶解。100mg X-gluc(MW＝521.8)用9.58ml DMSO溶解,得到的母液浓度为20mM。

②50mM磷酸缓冲液(pH7.0)的配制如下：

A液：NaH₂PO₄·2H₂O 3.12g溶于无菌蒸馏水，定容至100ml；

B液：Na₂HPO₄·12H₂O 7.17g溶于无菌蒸馏水，定容至100ml；

取39mlA液与61mlB液混合，即得50mM磷酸缓冲液。

③染色液的配制：5mM铁氰化钾；5mM亚铁氰化钾；10mM EDTA；50mM磷酸缓冲液；1mM X-gluc。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 大豆花药、胚珠及根冠特异启动子GmFTL2及其应用

<130> KHP171110865.0TQ

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 9978

<212> DNA

<213> 大豆（Glycine max L.）

<400> 1

gtcgaccatg taaaaccttc attgtacttc tattaaggat taccctctat caagcaccta 60

acccccgaag atgatgcaag gatgaataat acattaaatt aaaataagaa aggataatag 120

gaaagaaaac acctatttgt attgatagat atgaaacata caatacattt tttggctttt 180

tagacctgtc aagccctaac taagggttta acctctcata gccataaggg gccttacact 240

tgaaaagggt ttagaactga tgtaggagaa gggatggaaa aagggaataa aaaatgatgg 300

agagaagaaa gaattcccta aggaagagtt ctcaggattg acgtgtatat tagagtgctc 360

tgagactcaa tgcgttttct ccttggcttg actctttttt tataattgct agagtggact 420

tgggcctgcg tactcacact aagtctgcac tactcgcttg gtgtgggtac ctgtattcgc 480

gcttagcgcg catcctcttg cttagtgcta gtgtgtgttt tcgcgctaag cacgcttctt 540

ctcgcttagc aagtacgcct gctttcgtgc tgggcgcgtg ctgcacgctg agtgcatcat 600

gagctgggcc tttcaaatat ttgctatttt ctgcatcttt tttactttta atccctcatt 660

ttcatatctg caagccatga ataggaagaa cattaattct taacaaataa acataaataa 720

ctactaaata aacattttta aggatatttc cattatattt ttagtataaa aaataactca 780

tatttaacag ttatcaatga catcttttat ctaatatcat cacagaagta ctcaaaaagt 840

tctaataact aaacgaatat ataatttgac aagagtataa cataacaaac tagtgattag 900

tacttctttc aatcattaga acttctcaag tcaagacgca atgagggcac aaaagttctt 960

atctatatca tctaaagttg actaccgctt ttaaccattt tgtggtgacc gtaaatataa 1020

tatataatag atttctaaaa caagccaaat gatgctaaga atggtagatg tatagtgtaa 1080

agttagatga aaacatatct aaccggatga atttcgcacg ctgatcataa gtggcatctg 1140

gtacagattt tgtaaataac cagaggagta tttcataatg ataatctaaa cagggtttta 1200

acaatttatg gccattggtc atgacaacct aaggccaact tactttgtag gcagtttccc 1260

attttaacca tattttaaag tatagcttta cctaaactat gctcagggtt gcaaatgtca 1320

caggatctga gaaatctcct tcaggtggcg aaacaaacac cataaattgt tacactacct 1380

gtacatttag gggccccaat tctaaacaga ggcaaagttt aaggagtata cgagatagag 1440

caactagatc agtgatgtta agcccttgtt gctcaagtct tgatactaaa aggttaagaa 1500

acaatttaat ttgacaaaat gttgtgtttt tatttttatt tcctctttta attacaaaaa 1560

tataatttta ttttacttta ttttctgttt taatttccaa agtttgaata gaaaataaga 1620

aaaataataa atttatttta ctatttcatg tacaaacttt tagtattttt gtaattaaaa 1680

ataataatat aaaatatttt tccaaaccaa ttaagtgaat ctgtcataag aagatactta 1740

caagaattgg aatatcttat aactaaggta ctcaaataaa ttcaaaaaaa gtttatatat 1800

ctctatgaga ttccttgtag ataaccatcc aacctactca acaactccct tcagaaacaa 1860

agaaaaagga cagagtaata caaaagccca aaactgaaat tcaaaggacc aagtaagggg 1920

acttgcatac ttttttttaa tttgtttaac aaagtcctaa tagcacccaa tacatccact 1980

tcattgagga gctaataagt aattttaaag tcaccaagtc aatatatgtc aaagctccat 2040

ccttgctcaa gtacacaaat tttattacac aacctctgat cctacttact attgtgttat 2100

gtcctttata gagttgaaat gttaaagtat tgttaagact taagagtaag gttatcaaac 2160

tcgagagttt acgtagaatc atgaaagttt catatactcg actcgtggac tcaattcgtg 2220

gactcgtaag agtctacttc atataaaaat aataataaag tatctataaa taacatacta 2280

attaaacatt tcaacaatat aataaagcaa aacagtaaat cataaggttc aacatattta 2340

aataacaaag tttagtaata atacatcact actagcaaat gttataatag tggtagatca 2400

ttctcatcga gggtttgata ttattggaga acaagggttt gatattatta aaggtgaaga 2460

ttttgtattt gagaataaca cactaaatga aggtatgttg aatgctagac agatagaaaa 2520

caatccaaaa tgacttacat tttggtctaa tttttttaac ttgctaactc gttgactcga 2580

tggtaaactc gagagtctac ttagagttta tagagtttgt ctagagtcta ctaaaaaaga 2640

gtttactcaa tagtcaactc gcagaagaca agtggacttg taaactcgta agagttaacg 2700

agttaacttg agagtttgat aaccatgagt actatcttta tacatatatg tcattaatag 2760

ttttttttat taatatattt tataattata atagataaac tcttatctta tgagttgttt 2820

gagatgagtt tgacaacctc acctgggaga accgtacaca agagctagct attgtagtca 2880

taaaacacac aaaacatgtc ttataaacct cacaataatt aagatcccaa ttagtcaagg 2940

tatttcacta aatacaatca atgaattcac aaatcaaaca aaacaaaccc aattatctaa 3000

cttaaaaact aaaccttttt caaacaataa ttttcacaaa cacccgagct acaattatag 3060

attagggaga ataatgttac cttgagcagt ggatctatga tagaggaatc catcattggc 3120

gaggttgatg gatttcggca ttgaaacatt ggttgatgcc acctcgaaca tggtgccgac 3180

aagtttgatc taagcctaca tctgggttaa gttatcggtg gtttcgacgg cggtcttttt 3240

cgacggcgac agggagggtg gtgtcgttgg cgagcaaaac attggaggcg gagaccaata 3300

actcgtcttg gtcgtaccca acaaagacct cccatgactt gagcttgtcg aggtcgttgt 3360

tgagcaccgt caccgttgac tcaaatttgt aaggttcctt tgctggatcg aagacattcg 3420

acggcaatcg cacatcgacg gtgtaggcat aggagacgag gatgccgttg cagaattggg 3480

cattggcgaa tgacatcgtt gcaaggaaca ttgctagcac gttgatgatg ctaaggtagt 3540

agcaacaatg acttcgaagg agcatctaaa ttttgaaatt tgaactaaga gaaagaaaca 3600

caatgcatca atatatataa cgttggcggc ttctcgtact aaacattaaa acccaacatt 3660

agtttttgaa aaaatcaatg ttaacaaaaa ttgattaaca tcgtcacgtt aacattgatt 3720

tttttttaaa aaaatgatat taataaatca atttatttac gaaaatatca ctgtcctttt 3780

gataacatct gtttttataa aaaaaaatta atgttaaaat aatgatgttg aaaacattct 3840

ttccggtggt tttaaactaa tgatatgtgg gtataattca aatcctcgtt aattagtttc 3900

cctctctcct ttaacaatca taataattat tagtattcta tcacatttaa tgaatgaaga 3960

gatgagatcc gacttacacc aaatctcatc cgttgatata actaaatcta atgatttata 4020

atattttaat ttaaaataaa aaatattaaa aaagtggtca cgtgataaaa tttcctaatc 4080

tctcttctcg ttactctttc tctcatccta gccacaacaa tctcaccgag tgccgccacc 4140

aaccaaccac cactccaaag ccatcaaatc accataccca aatcattgaa gcaccaagct 4200

cttctatgtc ttccacgatt gtgaccaatc cagattctgt accaccatgg aaaccacatg 4260

gtgctccctc cctctctcag acaactcatg gagtgccatc gcacttcatc ccatcagtgc 4320

ctaccccttc gtcagaccca acaatcatca cgccaccaag gtctttcatg gctgccacga 4380

tgtcgtgcta tccacaccac cacgaacctt tcaccagtca ttttgacact atctttcatc 4440

gtctcagatc acccttctct cgtgattgtc gaaaccttta tcgatgacaa cggcgttgga 4500

gtgttagcat ctccccaatc aaagcatcga tgagaattat agtgtcaagg agaattggaa 4560

atcaagattg tattagaaat acagctttag gaacaattaa aaatcaagat tttgataact 4620

aatttcagaa cttgtcaact tcaatggcgt atggagaatt acaattgtaa aattgatttt 4680

gtagttttga ttactatttt gaatagtatt ttctctatga ggttcatgat tttataagaa 4740

tttatgccca tcaatattgg ttgcatcata aaacaaattt gtgacaccaa cacgctgtgt 4800

tgcagagtta caaaggcatt ttttagggta caaggcacag gaagaaagtg tcgcgtgagt 4860

tacttgcttt acttgttttg attttttaat ttaattcatt atagccatgg gatttaatta 4920

tatcaacgga tgagatttag tgtaattctg gatagacttt ttccctcaca atttgcttgt 4980

aaattcttga tgaactttta aaagtggatt ttttgtttaa tgaggaattt ctttctttgt 5040

aaatctctag cttgcacatt tgtaacagaa tttctctcac aaatcttttg ccaatcctta 5100

tgaaaatttg aaaattggat ttttcgtatg caaaatcctt cgtgaatttg agaaatgaat 5160

ttttcattta tttattcaat aatataattt atatattcaa taatatttat tattataaat 5220

tttaattata ttgtgtaata ttttatttat cagtaaaatt tatttgaatt ttaattaatt 5280

tttactgatt aaaaagttat actataaata tttattctta tatataatta agttttactg 5340

gtataatttt aatattgtgt aatattcaaa ttaatatagc agtgtttatg tttactcatt 5400

taaataattt gaaatattta taataatata tacttcaaac aagtaatata tataatatct 5460

tttgatattt taattttagt ttttttgtta ggtaaagggt taacgacaaa gagagaatgt 5520

aagggagcca aaatccaaac aatatttttt tcatttttat ttctagaaaa acatgaagaa 5580

ttagatatta gataataagt acaattaata caaaatattt ttttaacaat cccaatcata 5640

tttttttttt tcatttataa gattaaaacc taaaacttta tttaaggaaa ttaaactcaa 5700

ttttactcag acctaccact tatatagacc caaaaaaact tttaaaataa tgaacttgag 5760

aaggaaccat tctaagtctg caagaaagtg aaaggccatt atatggcaag aagaaaaaag 5820

aattcactaa ttaatcctat accctgttac acaaaactac taaatattta tttttaatta 5880

ttattcaaaa taataaacaa catgattcta ttacaaaata gattacccct acctagatgc 5940

gataaaaaaa aacttaggtc tttctatcta ccttgtgttc ttctaaaaga gtgtatataa 6000

gcctttaatt tatgtgtaac ctcaacgaag tgagcatcca aaatgagagc aaaaagtatg 6060

tccaaaatag aacatgtgaa agtgtagtca agggactcat gcttccaaaa tgtgtttgta 6120

tgcacaacta agttagttgt atgtctcaac aacaagtgtg ctatgggtga agcttgaaga 6180

ggcttgggca agaatatttg ggttaagaag acctacaaag gtgataatat tggttgaaaa 6240

acttggagag atgataatac tgattccaaa acctgcagaa gtaagaataa taacatgaag 6300

aggtgataat actcaattga aaacttgacg aggagagaat agttagtgaa gacctaaaaa 6360

ggtgacaata ctggcttata gcaacttgta aaggtttgag aataattatt gagtagccta 6420

gataggcttg agaaaaacat tgtaaaagcc taaggatgct taaggagaca aaatatcctt 6480

ttgttgttgg tgtaattctt agtagaaaat cctacaagtg gtaaggaccg gatataaccc 6540

aagtttgagg gtgaaccagt ataaattttc tatgtgttac atcctacctt tgctttttgt 6600

acttatttgt tgcttgtgtg atttgttttt gaaaaacctt tagtttgaat attaaatcta 6660

attaaaacta agttaaaaac aactttcaag ttgtttttac actttagaag catcacgaca 6720

atatgataaa acttaagatc aaattgatga tcaacctcaa agaagatggt gatcaacaag 6780

gatgcagtgt ttgatgagta atccaagcta tatcagaaag atcagctagt gcccgttaca 6840

ggtggagctc cttagctctg tggaggttca ggtggactta caaaagttgc caaagatttc 6900

tgagagggca taaccatgta gtttgagacc tattcctaag accacttttg aatttggacc 6960

tatggattca gggggtcata agagcacact cttgtttgag atagagaacg tcacactgtc 7020

aaacctattg tgtgatatgg gtttgaagag ttagttactt ttgcatttct caccggttat 7080

gggaatctgc ctactttaat tgacgctatg aacctttagg agaaggacaa atggatgggt 7140

atcatggtag agagatggag tctttgcata agaatcatac atgggagtta attgagctac 7200

ctttaggcaa gagaaccata ggttgcaaat gggtgtataa gaggaaacct ctggtaataa 7260

aaaaggagaa tttttcaaga gtttcctatt tgcaaaaggg tattcataga agatggggat 7320

tgatatgatg agattttctc cctagttgag acacatttct atcagggcga cgctagcctt 7380

ggtagccagt gaagacatgc acttggagca gatggatgtg aagacaactt ttcttcacga 7440

tgacctagag gagcatattt acatgaagca gaatttaagg ttgcacaatg gaaactgttg 7500

agaattcgaa agggataaac actcgggaga tcttcactaa tgggtcatga gcaaaccata 7560

caagtgaact tgacgttaca cttcaactaa aaaaacttaa ggcattagat ttatggtttc 7620

ttctcgtata tgttacttaa cttgcccatt ctacccaatg tgagacttta ccttcacatt 7680

tatactctga caatcttcct atcatgtgtc agtctctttc atatggtagt ctctccctca 7740

agcagaagtc tttttcatca acgtgtatac agtggtgccc cttaaagctt aatcgtggtt 7800

tctccaccaa catattgtcc gtcattaggc ctttagagct ttagccattg agaccaagat 7860

gctctagcta gtaccttgca ctgtcattca accgtttcgt ggccatggga catgtcacct 7920

aacctccatg ttactaggaa gacttttgat ctccatatgt ggatccatca tcaggaagac 7980

tttcgataca aggaccgatc ctaatgctag gatccaccgc caattctgtt aatatactcg 8040

tctaagtcga tcacctagtc aaatcatcac tctgatatca attatcgaga atttgaaggg 8100

agaaaacact aggaagatct tcaccaatgg gtcacaaaca aaccacataa gtgaatttga 8160

cactacactt caactcaaaa ccttaatgca ttaggtttgt gggtctttcc acttatatgt 8220

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