一种启动子及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种启动子及其应用。
背景技术：
：随着人口持续增长，能源需求也不断扩大。然而，当今能源的主要来源还是石油、煤炭等不可再生能源，它给人们带来便利的同时，也不断给环境带来污染，如汽车尾气污染。因此，研究人员逐渐把目光转向可持续生产的清洁能源。微藻型生物柴油已经被视为潜在清洁可持续的能源，微藻具有生长周期短，光合自养，培养简单，占地面积比较少等特点，并能够利用酯基合成生物柴油，产油效率远远快于动物和植物，同时具有适应性非常强，某些微藻可以在极其恶劣的环境下面进行生存，如沙漠，污水中。然而，野生型的微藻产油效率还不能满足工业需求微藻基因工程，是改良其产油性状的一种手段。然而，在微藻中，缺少高效的遗传转化系统，大大限制了基因工程在微藻产油中的应用。因此，很有必要建立一套高效的遗传转化系统，其中载体是遗传转化体系的核心部分，而启动子是载体能否高效表达的关键元件。众所周知，启动子是一段位于基因5'端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。启动子一般由启动子核心元件和上游元件组成。位于转录起始位点上游-20～-30bp处的TATAbox为启动子核心元件，是富含有AT的保守序列区，与DNA(脱氧核糖核酸)双链的解链有关，并决定转录起始点的选择，是绝大多数植物启动子正确表达所必需的。TATAbox上游的保守序列称为启动子上游元件，包括上游-75bp处的CAATbox和-80～-110bp附近的GCbox等一般上游启动子元件及其他特殊的上游元件。大量文献表明启动子元件的种类、数量以及彼此间的顺序与距离都可能影响基因的转录与否或转录程度，不同基因其启动子的长度各有不同，所含元件也各有不同，因此，启动子的长度与其启动基因的转录有关。因此，寻找一个能高效启动基因表达的启动子是本领域技术人员亟待解决的技术问题。技术实现要素：有鉴于此，本发明针对现有技术中微藻启动子效率不高的缺点提供一种高效启动子及其应用。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种启动子，包括基本组成元件、诱导元件；所述基本组成元件为CAAT-box和/或TATA-box；所述诱导元件为光诱导顺式作用元件、光诱导转录元件、热诱导元件、脱落酸响应顺式作用原件(ABRE)、低温响应顺式作用原件(LTR)、光响应原件(Sp)中至少一种。作为优选，所述诱导元件中的光诱导顺式作用元件为-10promoterelement；所述光诱导转录元件为T-box或GT-1box；所述热诱导元件为CCAATbox。作为优选，所述启动子含有1个CAAT-box、1个TATA-box、1个脱落酸响应顺式作用原件(ABRE)、1个低温响应顺式作用原件(LTR)、1个光响应原件(Sp)、1个光诱导顺式作用元件、1个热诱导元件，所述各元件分散存在启动子序列中。在一些实施方案中，所述启动子具有如SEQIDNO.1所示核苷酸序列，所述启动子命名为PNaHsp20。在一些实施方案中，所述启动子具有SEQIDNO.1所示核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个核苷酸，且与SEQIDNO.1所示核苷酸序列具有至少70％同源性的核苷酸序列。作为优选，所述取代的核苷酸数目为1个-80个。如2个、3个、4个、…50个、…、70个等等。作为优选，所述启动子PNaHsp20启动热休克蛋白20的表达。进一步的，所述的启动子在启动下游基因高效表达中的应用。本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体含有启动子PNaHsp20。本发明还提供了一种宿主细胞，含有所述的表达载体。作为优选，所述的宿主细胞是微拟球藻、小球藻中的一种。作为优选，所述的宿主细胞在提高微藻目的产物产量中的应用。具体的，所述宿主细胞的制备方法，包括如下步骤：1)获得具有(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的核苷酸序列中任意一个的启动子：(Ⅰ)如SEQIDNO.1所示核苷酸序列；或(Ⅱ)经修饰、取代、缺失或添加一个或几个核苷酸，且与SEQIDNO.1所示核苷酸序列具有至少70％同源性的核苷酸序列；2)将步骤1获得的所述启动子与表达载体融合，构建重组表达载体，转化宿主细胞。作为优选，所述表达载体依次包括Ori、PNaHsp20、eGFP、TfcpA、AmpR_promoter、Ampicillin、PLDSP、Ble和TnR。其中，eGFP为绿色荧光蛋白；TfcpA为fcpA终止子；AmpR_promoter为氨苄基因启动子；Ampicillin为氨苄基因；PLDSP为LDSP启动子；Ble为博来霉素(在微藻中为zeocin基因编码)；TnR为硝酸还原酶终止子；Ori为复制起点。本发明还提供了一种生产目的产物的方法，含有所述的宿主细胞扩大培养后，在所述宿主细胞的生长平台期收集所述目的产物，分离纯化后获得所述目的产物。作为优选，所述目的产物为油脂或虾青素或管藻黄素或叶黄素。综上所述，本发明提供了一种高效率启动子及其应用。本发明所述启动子在微藻整个繁殖周期均可高效启动下游基因的转录表达。本发明的PNaHsp20位于微拟球藻染色体中，全长531bp。本发明所述启动子序列没有任何文献报道过，在GenBank等公开数据库也没有任何注释是启动子及何种特征的启动子。本发明为首次发现并鉴定该启动子的功能、启动效率。因此可将其应用于基因工程中，在基因工程中有良好的应用前景。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示pNA03载体图谱，其中，eGFP：绿色荧光蛋白；Phsp20：PNaHsp20启动子；TfcpA:fcpA终止子；AmpR_promoter：氨苄启动子；Ampicillin：氨苄基因；PLDSP：LDSP启动子；Ble：博来霉素(zeocin编码)；TnR：硝酸还原酶终止子；Ori：复制起点；图2示微藻筛选平板图，其中，pNA03是转化藻，WT是野生藻；图3示转化藻分子鉴定胶图，其中左边WT为野生型藻，右边为转化型藻；图4示转化藻EGFP荧光共聚焦观察，其中，A是野生藻，B是转化藻；图5示转化藻基因组测序分析，其中A为转化藻eGFP比对结果，B是博来霉素比对结果；图6示转化藻的qPCR分析，eGFP-1和eGFP-2为转化藻，WT为野生藻；**为P<0.01；图7示转录效率比较图。具体实施方式本发明公开了一种启动子及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明提供的一种启动子及其应用，其中所用原料及试剂均可由市场购得。实施例所用微藻为微拟球藻(Nannochloropsisoceanica)。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1：启动子和eGFP基因的克隆基因克隆步骤如下：1)采用omegaDNA(china)试剂盒提取微拟球藻的基因组DNA。引物由上海生工生物工程有限公司合成，经PAGE方法纯化，使用时稀释到100μM。启动子PNaHsp20在微拟球藻DNA中克隆，eGFP基因从含有eGFP的通用载体中克隆。其中克隆条件均采用PCR方法，使用KOD-plus-Neo酶(TOYOBO，JAPAN)PCR获得，启动子PNaHsp20、eGFP基因、LDSP启动子和Ble基因的PCR引物如表1所示，PCR反应体系分别如表2和表3所示。表1相关引物名称编号序列(方向为：5’-3’)NHY01FSEQIDNO.2GGCACAGGATGAGTTTTCTCGAGGTCGACaaccctgataaatgcttcaataataNHY02RSEQIDNO.3CATCTTATAACTTCGTATAGCATACAATCATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGNHY03FSEQIDNO.4CCACCACCAATCTCAGCCCGCATCAACAACCATGGCCAAGCTCACTTCTGCCNHY04RSEQIDNO.5ACTTGGGCTGTGTATAAGGGAGCCTGACTTAGTCCTGCTCCTCAGCCACAANHY05FSEQIDNO.6AAAGCGGGCAGTGACTGCTGCTGCTGCTGACGGAAGATCACTACGGCAGNHY06RSEQIDNO.7GTTTGTTGTTGTTGGTAATTGTTGTAAAAATATTTATTGGGGTTTAGAGTGTGGTACNHY07FSEQIDNO.8GACCAAAATGATTGTATGCTATACGAAGTTATAAGATGGAGTGGATGGAGGAGGNHY08RSEQIDNO.9ACAGGAACGGCAGAAGTGAGCTTGGCCATGGTTGTTGATGCGGGCTGAGATTGGNHY09FSEQIDNO.10TTACTATTTACAATTAcaatCCAGTGGTGTGGTGGCGGCCGCACCATGGTGAGCAAGGGCGANHY10RSEQIDNO.11TTTTGTTCCAGGTGTGTGGTGGCGGCCGCCTCGAGCTTGTACAGCTCGTCCNESEQIDNO.12ATGGTGAGCAAGGGCGANaSEQIDNO.13ATGGCCAAGCTCACTTCTGCCeGFP-F1SEQIDNO.14AAGCAGAAGAACGGCATCAAeGFP-RQSEQIDNO.15TCCAGCAGGACCATGTGATCNa01FSEQIDNO.16ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGNa02RSEQIDNO.17CTTGTAGTCCAGGTGTGTGGTGGCNA03SEQIDNO.18ATGGCCAAGCTCACTTCTGCCGTNA04SEQIDNO.19TTAGTCCTGCTCCTCAGCCACAAactin-F1SEQIDNO.20TGTGCGTGACATCAAGGAactin-R1SEQIDNO.21GCCAATCACGATCACGTTT表2启动子PNaHsp20PCR反应体系(20μl)表3eGFP-MCS基因PCR反应体系(20μl)表4LDSP启动子PCR反应体系(20μl)表5zeocin基因PCR反应体系(20μl)反应条件为：预变性：94℃，2min.把上述克隆氨苄原核表达盒片段(从含有氨苄原核表达盒的PMD19载体克隆)，zeocin基因(上海生工生物工程有限公司)，PNaHsp20启动子和LDSP启动子，GFP-MCS片段，并在上海生工公司合成2xFlag片段，以本实验PHY18号载体为骨架，使用重叠PCR的方法，分别依次将氨苄原核表达盒，zeocin基因，PNaHsp20启动子和LDSP启动子，eGFP基因，2xFlag片段无缝连入PHY18载体，过程采用的PCR酶为NEB高保真Pfu聚合酶，得到如图所示的Pna03载体，重组过表达载体结构如图1。实施例2：微拟球藻转化及转化藻的筛选第一步，对重组过表达载体(pna03)使用ScaI限制性内切酶(TAKARA)进行线性化，孵育8h，然后使用DNA片段纯化试剂盒(takara)进行纯化；第二步，将线性化的重组过表达载体进行电击转化，方法如下：4400rpm，10min离心收集藻细胞，使用375mm无菌山梨醇对3次洗涤，尽可能去除里面的海水，最后，使用150ul无菌山梨醇溶液重新悬浮藻细胞，加入30ug的预冷的硅精DNA(已经95度加热1min)，和3ug的pNa03线性化质粒，冰上静置10min，使用电击仪器进行电击，条件如下：2.2kv，电容为50Uf，电容为600ohms；第三步，电击完成后，将藻细胞转移到5mL的f/2无硅培养基，黑暗培养24h。随后，将5ml藻细胞离心10min(4400rpm)收集，并均匀涂到含有5μg/mL博莱霉素的平板中。如图2所示，pNA03平板上出现单藻落，把单藻落挑出来扩大培养，筛选出eGFP-1和eGFP-2两株转化藻。实施例3：转化藻的验证在分子水平上验证，采用RNAisolationkit(takara)试剂盒对出eGFP-1和eGFP-2两株转化藻和野生藻进行RNA的提取，并使用PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser(PerfectRealTime)逆转录试剂盒(takara)，用Na01F和Na02R，NA03和NA04引物分别对eGFP转化藻和野生藻的eGFP基因和zeocin基因进行扩增。如图3所示，eGFP转化藻出现了750bp的eGFP电泳条带和375bp的zeocin的电泳条带，而野生藻则没有，回收eGFP转化藻750bp和375bp电泳条带，分别使用NE和Na进行测序，随后在NCBI网上进行blast比对，结果如图4显示，750bp的电泳条带确实为eGFP的序列，而375bp为zeocin序列。说明了PNaHsp20启动子和LDSP启动子都成功启动基因转录。实施例4：微拟球藻荧光共聚焦观察在表观上验证，把100ml转化藻和100ml野生型微拟球藻3000g离心5min收集，对野生藻和转化藻进行激光扫描共聚焦荧光显微镜观察，荧光值测定过程如下：取1ml的藻细胞，使用酶标仪，设定激发波长为488nm，发射波长为505-530nm，进行读数，同时进行细胞计数。结果如图5所示，在野生藻中，没有看到有微藻发出绿色荧光，而在eGFP转化藻中，eGFP的荧光很强。因此，结果表明PNaHsp20启动成功启动了eGFP基因，而且eGFP基因成功表达蛋白。实施例5：对转化藻验证其过表达的效率本发明对eGFP转化藻进行荧光实时定量分析。野生藻和转化藻放置新的培养基中，控制藻密度在1x106个/ml，取第十天的微藻，微藻的数量控制在3x108个，在4400rpm条件下离心10min，获得微藻后采用RNAisolationkit(takara)对微藻的总RNA进行提取，并使用thePrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser(Takara)试剂盒进行逆转录。利用eGFP基因的特异引物eGFP-F1和eGFP-RQ进行实时定量扩增，内参引物：actin-F1和actin-R1。实验所用的检测设备为ABIPRISM7500SequenceDetectionSystem(AppliedBiosystems，USA)。如图6所示，与野生藻相比，eGFP-1转化藻mRNA表达水平是对照3.59倍，而eGFP-2的转录水平是野生藻的2.92倍，结果表明Pna03-eGFP的载体成功在微拟球藻中表达。与已有报道的Pstarvation–induciblepromoter(ManipulationofoilsynthesisinNannochloropsisstrainNIES-2145withaphosphorusstarvation–induciblepromoterfromChlamydomonasreinhardtii，《FrontiersinMicrobiology》，2015，6:912)相比较，PNaHsp20启动子启动基因的转录效率大概高1倍(图7)。综上所述，本发明发现了在微藻中能高效启动下游基因的启动子，而且所述启动子长度较短，方便重组载体的构建，在基因工程领域具有广泛的应用前景。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。SEQUENCELISTING<110>暨南大学<120>一种启动子及其应用<130>MP1622272<160>21<170>PatentInversion3.3<210>1<211>531<212>DNA<213>人工序列<400>1tgacggaagatcactacggcagattgaaggggtggtagggaagtggtcagcacatttaat60ataagcaacaaaatatactgtcggatatcgctgtcagccagcaggaaatattgagggtaa120atatcacaacacctgtgggcatgccgaaaaggcagggtaagagtggacagtgctccctca180tatcctcaagcaggccttgctgttgcgtgaggggcattcgcctacagcgacgacatgtcg240gagcttcaactcgtactctttcaagaactaattctagaaaacccggccggccggctggca300atgttctgtttgttccaaaatactgtgcgttgtttgtatgtgtttatgctaatgtcgtac360gtggctatacatttcttttggcagtccaatatatgttcatgcttatatcgtacgtggcta420tacatttcttttggcagtccaaacaagctcacaagacaccctacccatcccacacacctt480tccaccaccctttccacaagcagctggtaccacactctaaaccccaataaa531<210>2<211>54<212>DNA<213>人工序列<400>2ggcacaggatgagttttctcgaggtcgacaaccctgataaatgcttcaataata54<210>3<211>56<212>DNA<213>人工序列<400>3catcttataacttcgtatagcatacaatcattttggtcatgagattatcaaaaagg56<210>4<211>52<212>DNA<213>人工序列<400>4ccaccaccaatctcagcccgcatcaacaaccatggccaagctcacttctgcc52<210>5<211>51<212>DNA<213>人工序列<400>5acttgggctgtgtataagggagcctgacttagtcctgctcctcagccacaa51<210>6<211>49<212>DNA<213>人工序列<400>6aaagcgggcagtgactgctgctgctgctgacggaagatcactacggcag49<210>7<211>57<212>DNA<213>人工序列<400>7gtttgttgttgttggtaattgttgtaaaaatatttattggggtttagagtgtggtac57<210>8<211>54<212>DNA<213>人工序列<400>8gaccaaaatgattgtatgctatacgaagttataagatggagtggatggaggagg54<210>9<211>54<212>DNA<213>人工序列<400>9acaggaacggcagaagtgagcttggccatggttgttgatgcgggctgagattgg54<210>10<211>62<212>DNA<213>人工序列<400>10ttactatttacaattacaatccagtggtgtggtggcggccgcaccatggtgagcaagggc60ga62<210>11<211>51<212>DNA<213>人工序列<400>11ttttgttccaggtgtgtggtggcggccgcctcgagcttgtacagctcgtcc51<210>12<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>12atggtgagcaagggcga17<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>13atggccaagctcacttctgcc21<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>14aagcagaagaacggcatcaa20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>15tccagcaggaccatgtgatc20<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>16atggtgagcaagggcgaggag21<210>17<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>17cttgtagtccaggtgtgtggtggc24<210>18<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>18atggccaagctcacttctgccgt23<210>19<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>19ttagtcctgctcctcagccacaa23<210>20<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>20tgtgcgtgacatcaagga18<210>21<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>21gccaatcacgatcacgttt19当前第1页1 2 3