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分子克隆方法总括-孟文举-HB170807
2017-9-7 阅读(2395)
分子克隆知多少
*个人造生命细胞——Mycoplasma mycoides
2010年，借助于已知的基因组序列信息，伟大的JCVI研究所（J. Craig Venter Institute）的伟大的合成生物学博士Daniel Gibson及其同事精心设计、合成并巧妙组装出完整的Mycoplasma mycoides基因组（大小为1.08Mbp），并将之转移到不含任何基因组的受体细胞（Mycoplasma capricolum）中，进而人造出*个生命细胞——Mycoplasma mycoides细胞。令人惊奇的是，新的生命细胞表现出预期的表型特征，且具备自主复制的能力。需要特别提出的是：用于片段组装的分子克隆技术及酵母同源重组技术功不可没。
（图1.The assembly of a synthetic M. mycoides genome in yeast. DOI: 10.1126/science.1190719）
与PCR、qPCR等技术一样，作为分子实验室*手段，分子克隆技术被广泛用于多样的基因功能研究。所谓分子克隆指的是在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入宿主细胞内并获得持续稳定增殖能力和表达（现代分子生物学，第3版）。
分子克隆方法大全
分子克隆技术的发展经历3个阶段，*阶段为经典的T4 DNA连接酶介导的TA克隆及粘性末端克隆，第二阶段为基于DNA修饰酶的LIC系列克隆，第三阶段为基于DNA重组酶的Gateway克隆及一步法克隆（该方法与Daniel Gibson等所发明的技术原理相同，原理详见后面部分）。
分子克隆技术发展历程
常见的分子克隆类型
1.基于T4 DNA连接酶的克隆
本系列克隆使用的酶类为：T4 DNA连接酶（和限制性内切酶）。
T4 DNA连接酶作用：可以催化目的片段和载体zui后一位碱基上的5’磷酸基团和3’羟基形成磷酸二酯键，以实现将目的片段和载体连接成环状质粒。
限制性内切酶作用：可以对目的片段和载体识别并切割出相同的粘性末端，用于碱基互补配对。
根据是否使用限制性内切酶，可分为平末端克隆/TA克隆和粘性末端克隆。
1.1平末端克隆/TA克隆
该方法可用于目的基因的测序或保存，或用于文库构建等。其克隆原理和过程如图所示。
1.2粘性末端克隆
zui为传统、zui为经典的克隆方法，现在依旧被众多实验室广泛使用。该克隆方法可用于构建表达载体、转染质粒等。
2.基于DNA修饰酶的克隆方法
今天所介绍的该系列克隆方法依赖的酶为：T4 DNA聚合酶。
T4 DNA聚合酶的作用：具有3'→5'核酸外切酶活性和5'→3' DNA聚合酶活性。缺乏dNTP时，表现为3'→5'核酸外切酶活性，切割目的基因和载体，产生单链的DNA粘性末端；加入某一单独dNTP，3'→5'核酸外切酶活性和5'→3' DNA聚合酶活性平衡，掺入与切割动态平衡，切割终止。
因此，T4 DNA聚合酶为基础的克隆方法的关键是目的基因和载体间需要有一定数量的重叠序列。
2.1 LIC克隆法
通过T4 DNA聚合酶的3'→5'核酸外切活性分别处理目的基因和载体的PCR产物，产生12nt的5'突出互补末端，利用突出的互补末端之间的退火进行基因克隆。12nt为人为额外添加。
克隆过程：
1、用5'端带有重叠序列的特异性引物分别扩增目的DNA基因和载体，获得带有重叠序列的目的基因和线性化质粒；
2、使用T4 DNA聚合酶的3'→5'核酸外切酶活性分别消化PCR扩增得到的目的基因和载体；
3、产生粘性末端后，添加某一成分dNTP，终止切割；
4、将带有重叠序列的两个片段进行退火，就形成了带有切口的环状质粒；
5、转化后，大肠杆菌内的修复机制修复损伤的DNA分子，经过复制得到大量目的质粒。
2.2 SLIC克隆法
与LIC克隆不同，SLIC克隆中目的基因和载体的重叠序列使用的是载体末端序列，因此SLIC克隆为无缝克隆。
克隆过程：
1、用带有重叠序列的特异性引物扩增目的基因，用限制性内切酶或PCR扩增得到线性化质粒；
2、T4 DNA聚合酶分别处理PCR扩增得到的目的基因和线性化质粒一段时间；
3、产生粘性末端后，添加某一单独dNTP终止反应，从而得到含有一段粘性末端的目的基因和线性化质粒；
4、然后目的基因和线性化质粒经过变性、退火，得到带有“缺口”的环状质粒；
5、转化后，经过大肠杆菌体内修复机制，获得完整环状质粒。
3.基于重组酶的克隆方法
今天介绍的该系列克隆方法虽同为重组法克隆，但酶的性质不同，故分开论述。
3.1 Gateway克隆法——实现基因在不同类型载体间“穿梭”
该技术依赖的酶：λ整合酶Int、λ切除酶Xis、大肠杆菌IHF因子。
该技术需要四个特异性重组位点（attB、aatP、attL、attR），引导发生两个特异性重组反应（BP反应和LR反应）。
BP反应：将目的基因克隆进入入门质粒。使用到的酶为Int和IHF。
LR反应：将入门质粒中的目的基因转移到终载体中，获得表达载体。使用到的酶为Int、IHF及Xis。
终载体若带有attR位点，则带有attL位点的入门克隆便可以与之发生LR反应，进而将入门克隆的目的基因转移到不同类型的终载体中。
3.2 一步法克隆——Daniel Gibson发明的分子克隆方法的“简版”
该技术依赖的“重组酶”：核酸外切酶、高保真DNA聚合酶及连接酶。
该技术的基础同样为：目的基因和载体之间需要15-20bp的重叠序列。
前文提到的LIC、SLIC等方法都要“粘性”末端暴露、添加dNTP终止和“粘性”末端退火等过程，操作繁琐。而一步法克隆能够在一个反应体系中实现“粘性”末端暴露、退火及片段的组装。
3.5 TOPO克隆——zui快速、的克隆
Topo克隆技术依赖的酶为：兼具内切酶活性与连接酶活性的拓扑异构酶Ⅰ。
拓扑异构酶Ⅰ的作用：识别特定序列位点（CCCTT），并在2min内对位点处完成80%的酶切连接反应。
因此，Topo克隆反应仅需2-5min完成。Topo克隆技术是潜力的克隆技术。
4.其他克隆方法
不同克隆方法的联合使用，可实现快速的克隆。如使用一步法克隆将目的基因克隆进入入门载体后，与Gateway克隆结合可实现目的基因在不同终载体中的穿梭。同理，使用Topo克隆与Gateway克隆联合亦可达到相同目的。
选择*的克隆方法
特征 | Topo 克隆 | 一步法 克隆 | Gateway克隆 | SLIC 克隆 | 粘性末端克隆 | TA克隆 |
关键酶
| 拓扑异构酶Ⅰ
| 核酸外切酶 DNA聚合酶 DNA连接酶 | λ整合酶Int λ切除酶Xis IHF因子 | T4 DNA聚合酶
| T4 DNA连接酶 限制性内切酶 | T4 DNA连接酶
|
反应时间 | 2-5min | 20-50min | 70min×2 | 30min+30min | 15min/12-16h | 15min/12-16h |
实验步骤 | 4 | 4 | 7 | 5 | 6 | 4 |
插入片段大小 | 5kb | ＞5kb | 100bp-11kb | ＞5kb | 受载体限制 | 较小片段 |
一次性插入片段个数 | 1 | 1-5 | 1-4 | 1-10 | 1 | 1 |
克隆效率 | 100% | ＞95% | ＞95% | - | 50% | 60-80% |
重组载体大小 | ≤8kb | ≤16kb | - | ≤19kb | - | ＜6kb |
局限性
| 1、载体固定，构建表达载体需亚克隆
| 1、引物较长
| 1、价格昂贵 2、需要带有特异性att位点的载体 3、引物较长
| 1、引物较长 2、步骤较一步法克隆复杂
| 1、受酶切位点的限制 2、受T4 DNA连接酶的限制 3、假阳性高 4、无法进行多片段克隆 5、步骤繁琐 6、费时 | 1、受T4 DNA连接酶的限制 2、假阳性高 3、进行基因功能研究时，需要亚克隆
|
主要优势
| 1、快速、简便、室温操作 2、克隆效率高 3、用于A尾PCR产物/平末端PCR产物克隆 4、自带载体 5、价格便宜
| 1、快速、简便 2、克隆效率高 3、不受酶切位点限制 4、一步多片段克隆、点突变克隆 5、适用于任意载体任意片段 6、价格便宜 | 1、反应迅速 2、克隆效率高 3、不受酶切位点限制 4、可实现基因在不同载体间穿梭 5、自带载体
| 1、不受酶切位点限制 2、适用于任意载体任意片段 3、可进行多片段克隆
| 1、方法建立zui久 2、可分步进行，便于检查问题
| 1、简便
|
HB170904
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